서 론
재료 및 방법
시험재료
시료 추출물 제조
총 폴리페놀 함량
총 플라보노이드 함량
DPPH 라디칼 소거능
ABTS 라디칼 소거능
아질산염 소거능
RAW 264.7 대식세포 배양
세포생존율 측정(MTT assay)
대식세포에서의 NO 생성
Cytokines(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 측정
Tyrosinase 활성 저해 효과 측정
통계처리
결과 및 고찰
총 폴리페놀과 플라보노이드 함량
DPPH 라디칼 소거능
ABTS 라디칼 소거능
아질산염 소거능
세포 생존율 측정(MTT assay)
NO 생성 및 Cytokine 억제 효과
Tyrisonase 활성 저해효과의 측정
적 요
서 론
메밀은 마디풀과(Polygonaceae)에 속하는 쌍자엽 식물로 일반메밀(Fagopyrum esculentum)과 쓴메밀(Fagopyrum tataricum)로 분류된다. 메밀은 아시아, 유럽, 남아프리카, 캐나다, 미국, 브라질 등 전 세계적으로 여러 나라에서 재배되고 있다(Kreft et al., 2006). 메밀은 생육기간이 다른 작물에 비교하여 비교적 짧고 내한성과 흡비력이 강한 특성을 가지고 있다(Li and Zhang, 2001). 특히 메밀은 일년에 봄과 가을 두 작기 재배가 가능하여 다양한 작부체계에 활용되고 있으며, 특화단지 조성 및 문화축제와 연계하여 그 수요가 지속적으로 증가하고 있다.
최근 건강기능성 식품에 대한 소비자의 관심이 증가함에 따라, 메밀은 다이어트 및 건강 유지에 도움이 되는 기능성 곡물로 주목받고 있다. 메밀의 영양성분은 필수아미노산, 지방산, 무기질(Ca, Fe, Zn, Mg 등), 비타민(A, E, C, B1, B2)뿐만 아니라, 다양한 페놀 화합물을 함유하고 있다(Lee et al., 1993; Kim et al., 1994; Kwon, 1994; Suh et al., 1997). 특히, 메밀에 들어있는 루틴(rutin)과 퀘르세틴(quercetin) 등의 플라보노이드 계열 물질은 항산화, 항염증, 항고지혈증 작용을 통해 여러 질병 예방에 기여할 수 있다고 알려져 있다(Yoo et al., 2012). 메밀의 기능성 성분은 주로 이용되는 종자보다 잎과 줄기 부위에서 더 많이 검출되는 것으로 보고되고 있다(Uddin et al., 2013). 페놀화합물의 함량은 품종과 식물체 부위별로 차이를 보이며, 일반적으로 꽃, 잎, 줄기, 뿌리 순으로 높은 함량을 나타낸다(Park et al., 2005). 그러나 기존의 유기용매를 이용한 추출법은 식품용으로 적용하기에 한계가 있어, 보다 안전하고 효율적인 추출 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다(Cheigh et al., 2011; Ko et al., 2014).
이에 본 연구는 일반메밀의 다양한 기능성을 가진 일반메밀잎의 열수 추출 및 에탄올 추출에 따른 항산화 및 항염증 효과를 검증하고, 일반메밀 잎에 있는 항산화 물질의 추출을 극대화하기 위한 최적 추출 조건을 탐색하고자 한다. 이를 통해 일반메밀의 기능성 식품 소재로서의 가치를 제고하고, 향후 일반메밀을 활용한 건강기능성 제품 개발에 기초 자료를 제공하고자 실시하였다.
재료 및 방법
시험재료
본 연구에 사용된 일반메밀의 재배는 충청북도 청주시에 위치한 충북대학교 온실에서 수행되었다. 주간온도 30℃, 야간온도 20℃, 습도는 20~25%로 하여 일반메밀종자를 한 화분에 2주가 되게 파종하였다. 파종 후 30일 후에 잎을 채취하여 불순물을 제거하였다.
시료 추출물 제조
일반메밀의 잎은 건조기 50~70℃에서 15시간 건조하여 막자와 사발을 이용하여 분쇄 후 50 mesh 체로 쳐서 사용하였다. 잎의 물 추출은 시료 50 g에 10배의 증류수를 가하여 80℃에서 24시간 동안 교반기로 진탕하면서 2회 열수 추출하였다. Ethanol 추출은 분말상태의 시료 중량에 10배의 ethanol의 농도를 50, 70, 100%로 하여 24시간 실온에서 진탕하여 2회 반복 추출한 다음, 실온에서 여과한 후 추출액을 회전 감압 농축기로 농축하였다. 농축된 추출물은 초저온냉장고에 보관하여 각 실험에 사용하였다.
총 폴리페놀 함량
총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu phenol reagent를 이용하여 분석하였다. 추출물의 농도를 일정 농도로 맞추어 0.25 ml씩 test tube에 취하고, Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 0.5 ml와 혼합 후, 상온에서 5분간 방치한 뒤, 7.5% sodium carbonate (Na2CO3) 0.5 ml를 추가하여 30℃에서 90분간 반응시켰다. 이후 spectrophotometer를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 chlorogenic acid을 표준물질로 사용하여 검량선으로부터 구하였다.
총 플라보노이드 함량
총 플라보노이드 함량 측정은 1 mg/ml의 농도로 추출물을 80% methanol에 용해한 후, diethylene glycol 10 ml와 1N-NaOH 0.1 ml을 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 naringin을 사용하였다.
DPPH 라디칼 소거능
DPPH 소거능은 Choi et al. (2003)의 방법에 따라 수소전자공여능을 측정하였다. 여러 농도의 시료를 메탄올을 용해시킨 후, 900 μL의 DPPH (2,2-diphenyl-1-picryllhydrazyl) 용액(100 μM)과 시료 100 μL를 혼합하여 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 수소전자공여능은 각 실험을 3회 반복하여 평균을 낸 다음 대조구에 대한 흡광도의 감소 정도를 다음 식에 의하여 계산하였다.
: DPPH radical 소거능에 대한 항산화 활성(%)
: 시료가 첨가되지 않은 DPPH 용액의 흡광도
: 반응용액 중의 DPPH와 시료의 반응한 흡광도
ABTS 라디칼 소거능
ABTS 소거능은 7.4 mM ABTS (2,2'-azinbis-(3-ethyl- benzothiazoline-6-sulfonic acid) 용액과 2.6 mM 과황산칼륨(potassium persulphate)을 혼합하여 15시간 반응시킨 후, 흡광도가 1.5가 되도록 희석하였다. 각 농도별로 조제한 시료를 ABTS 용액에 혼합하고, 실온에 90분간 방치한 후 414 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양이온 소거능은 ascorbic acid를 표준물질로 사용하여 RAEAC (relative ascorbic acid equivalent antioxidant capacity)로 나타내었다.
: ascorbic acid 넣었을 때 흡광도 변화,
: ascorbic acid의 농도
: 시료 넣었을 때 흡광도 변화, : 시료 농도
아질산염 소거능
시료 추출물의 아질산염 소거능은 1 mM NaNO2 용액에 시료를 첨가한 후 37℃에서 1시간동안 반응시킨다. 이후 2% acetic acid와 Griess 시약(30% acetic acid로 조제한 1% sulfanilic acid와 1% naphthylamine을 1:1 비율로 혼합한 것)을 추가하고 15분 동안 반응시킨다. 그 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 아질산염 소거능을 계산하였다.
: nitrite scavenging ability
: absorbance of 1 mM NaNO2 added sample after standing for 1hour
: absorbance of 1 NaNO2
: absorbance of control
RAW 264.7 대식세포 배양
마우스에서 유래된 대식세포주인 RAW 264.7 cell은 실험을 위해 한국세포주 은행(KCLB; Seoul, Korea)에서 분양을 받았으며 RAW 264.7 cell을 10% fetal bovine serum (FBS)이 포함된 DMEM 배지를 사용하였으며, RAW 264.7 cell은 24 well plate에 2×105를 분주하고 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 이를 현미경으로 관찰하여 세포가 분화된 것을 확인한 후 시험에 사용하였다.
세포생존율 측정(MTT assay)
RAW 264.7 대식세포에 대한 메밀잎 추출물의 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실행하였다. 즉, 계대배양중인 RAW264.7 세포를 96 well plate에 세포수를 조정한 다음 추출물을 첨가하고 1시간 배양 후 LPS 1 µg/ml을 각 well에 처리하였으며, 4시간 후 10% SDS (0.1 N HCl) 100 µl를 처리하여 18시간 동안 빛을 차단하며 반응시켰다. Microplate reader를 이용해서 각 well의 흡광도를 570 nm에서 측정하고 대조군의 흡광도와 비교하여 세포생존율을 백분율로 환산하였다.
대식세포에서의 NO 생성
RAW264.7 세포는 1×106 cells/mL 농도로 5% FBS가 포함된 DMEM에 부유시킨 후, 12 well plate에 800 µL씩 부착하였다. 이후 시료를 처리하고, 대식세포 자극제인 LPS를 1 µg/mL 농도로 처리하였다. 24시간 후, 배양 상등액 100 µL를 취하여 96 well plate로 옮기고, 100 µL의 Griess Reagent (Sigma)를 추가하였다. 그 후 10분 동안 실온에서 빛을 차단한 채 반응시킨 후, ELISA reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 최종적으로, Sodium nitrite 표준 검량선을 이용해 대식세포가 분비한 nitric oxide의 농도를 계산하였다.
Cytokines(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 측정
6-well plate에 세포를 분주한 후, 메밀잎 추출물을 처리한 다음 1시간 후, LPS를 처리하였다. LPS 처치 후 6~12시간 동안 배지를 수거하여 cytokine을 측정하였다. 수거된 배지는 측정 전까지 -70℃에서 보관하였다. Cytokine의 측정은 ELISA Kit(Pierce Endogen, Rockford, IL, USA)를 사용하여 IL-1β, IL-6, TNF-α를 분석하였다.
Tyrosinase 활성 저해 효과 측정
미백효과를 평가하기 위한 tyrosinase 활성 저해 실험은 Flurkey (1991)의 방법을 기반으로 변형하여 수행하였다. Tyrosinase는 tyrosine을 DOPA로 변환한 후, DOPA- quinone으로 전환시켜 melanin 색소를 생성하는 반응에 중요한 역할을 한다(Hearing and Jiménez, 1987). 실험에 사용된 효소액은 mushroom tyrosinase(Sigma, USA)를 100 unit/mL 농도로 희석하여 0.2 mL를 사용하였다. 기질로는 10 mM 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine과 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 6.8)를 혼합하여 0.6 mL를 준비하였다. 각 시료는 0.2 mL씩 주입한 후, 잘 혼합하여 37℃에서 약 20분간 반응시켰다. 이후, spectrophotometer를 사용하여 흡광도 475 nm에서 측정하였으며, tyrosinase 활성 저해능은 다음의 식을 이용해 계산하였다.
저해율(%)={1‒(무첨가군의 흡광도/시료첨가군의 흡광도)}×100
통계처리
모든 자료의 통계분석은 3회 반복 실험하였으며, 실험결과의 통계분석은 Statistical Analysis System(SAS 버전 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 평균과 표준편차를 구하였고, Duncan’s multiple range test (p<0.05)로 유의성을 검정하였다.
결과 및 고찰
총 폴리페놀과 플라보노이드 함량
추출용매별 일반메밀잎의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량은 추출용매 종류와 에탄올 농도에 따라 유의적인 차이를 보였다. 열수추출 대비 에탄올 추출물에서 더 높은 함량이 확인되었으며, 특히 고농도의 에탄올 사용시 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 증가하는 경향을 보였다(Table 1). 총 폴리페놀 함량은 에탄올 100% 추출물에서 297.35±5.13 mg/g으로 가장 높았으며, 열수추출물(256.14± 8.6 mg/g)보다 16% 높았다. 총 플라보노이드 함량도 유사한 패턴으로 에탄올 100% 추출물(209.56±2.53 mg/g)이 열수추출물(195.69±3.99 mg/g) 대비 7% 높은 값을 나타냈다. 에탄올 농도 증가와 함께 추출 성분 함량이 상승하는 경향은 기존 연구와 부분적으로 일치하나, 최적 농도에서 차이가 관찰되었다. 유백피 추출물의 폴리페놀 함량은 30% 에탄올에서 최대 폴리페놀(353.2 mg/g)이(Kim et al., 2012), 산딸나무 열매 추출물에서는 60% 에탄올 추출물에서 가장 높은 총 페놀(20.08 mg GAE/g)과 총 플라보노이드(0.86 mg QE/g)가 검출된(Ko et al., 2018) 반면 본 실험에서는 100% 에탄올에서 가장 높았다. 이는 추출하는 식물조직의 차이와 추출시간, 온도 등 조건의 변수가 작용한 결과로 판단되었다.
Table 1.
Total polyphenol and flavonoid contents in common buckwheat leaves under various extraction conditions.
| Solvent | Total polyphenol (mg/g extract)1) | Total flavonoid (mg/g extract)1) |
| Hot water2) | 256.14±8.60c | 195.69±3.99c |
| EtOH 100%2) | 297.35±5.13a | 209.56±2.53a |
| EtOH 70%2) | 272.55±5.38b | 206.51±2.06b |
| EtOH 50%2) | 268.15±8.88bc | 201.47±4.81bc |
DPPH 라디칼 소거능
다양한 추출방법과 농도 조건에서 메밀잎 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 나타났다. 추출용매에 따라 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10 mg/ml 등 6가지 농도의 메밀잎 추출물의 DPPH 소거활성은 열수추출물에 비해 에탄올 추출물에서 더 높은 활성을 보였으며 에탄올 농도가 증가할수록 소거활성이 증가하는 경향을 나타냈다(Table 2). 특히 100% 에탄올 추출물에서 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였으며 10 mg/ml 농도에서 97.23%의 가장 높은 결과로 농도에 따라 DPPH 소거 활성이 증가하는 농도 의존적인 경향을 나타냈다. Ahn et al. (2021)의 연구에서 아티초크 추출물에서 물 추출물이 가장 낮은 활성을 보였고, 에탄올의 농도가 증가할수록 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하는 경향을 보여 본 연구결과와 유사한 경향이었다. DPPH 라디칼 소거능 측정법은 짙은 보라색을 가지는 DPPH가 방향족 화합 및 아민류 물질에 의해 전자공여능으로 환원되어서 DPPH가 탈색하게 되는 원리를 기반으로 한 항산화 실험법이다(Kang et al., 2002). 그러나 메밀잎은 100% 에탄올 추출물에서 가장 높은 활성을 나타낸 반면 아티초크는 50% 에탄올에서 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보여 약간의 차이가 있었다. 이러한 결과는 식물 종류에 따라 최적의 추출 조건이 달라질 수 있음을 시사하며 항산화 물질을 효과적으로 추출하기 위해서는 각 식물의 특성에 맞는 적절한 추출 방법 선택해야 함을 보여준다.
Table 2.
DPPH radical scavenging activities of extract obtained using different extraction methods.
| Solvent | DPPH radical scavenging activity, % of control1) | |||||
| Concentration (mg/mL)2) | ||||||
| 0.25 | 0.5 | 1 | 2.5 | 5 | 10 | |
| Hot water | 8.40±0.45c | 12.78±0.56c | 16.03±0.31d | 32.51±1.04b | 38.20±1.70c | 76.38±0.94d |
| EtOH 100% | 15.40±0.22a | 18.48±0.78a | 28.81±0.42a | 42.30±0.70a | 71.82±1.78a | 97.23±0.38a |
| EtOH 70% | 11.02±0.92b | 15.70±0.37b | 23.25±0.27b | 32.60±1.84b | 66.47±0.40b | 95.18±0.90b |
| EtOH 50% | 9.48±0.55bc | 13.83±0.30c | 20.92±0.52c | 36.05±1.18b | 65.19±0.94b | 84.54±0.69c |
ABTS 라디칼 소거능
메밀잎 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성은 추출물의 농도와 에탄올 농도에 따라 유의적인 차이를 보였다(Table 3). 추출물의 농도가 증가함에 따라 ABTS 라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보였으며 모든 농도에서 에탄올 100% 추출물이 가장 높은 활성을 나타냈다. 추출물 1 mg/mL 농도에서 열수 추출물은 14.09±0.29%의 활성을 보인 반면, 에탄올 100% 추출물은 24.11±0.20%로 가장 높은 활성을 나타냈다. 에탄올 농도가 증가할수록 ABTS 라디칼 소거 활성이 증가하는 경향을 보였으며, 이는 다른 농도에서도 유사한 경향을 보였다. 20 mg/mL 농도에서는 모든 추출물이 80% 이상의 높은 활성을 보였으며, 에탄올 100% 추출물이 97.17±0.32%로 가장 높은 활성을 나타냈다. Ahn et al. (2021)의 연구에 따르면 아티초크 추출물에서 에탄올 농도가 증가할수록 ABTS 라디칼 소거활성이 증가하여 본 연구결과와 유사한 경향이었으나 80% 에탄올 추출물에서는 감소하여 에탄올 100% 추출물에서 가장 높은 활성을 나타낸 본 연구의 결과와는 다소 차이를 보였다. 이는 메밀잎의 특정 성분이 고농도 에탄올에 더 잘 용해되어 항산화 활성을 높이는데 기여했을 가능성을 시사한다.
Table 3.
ABTS radical scavenging activities of extracts obtained using different extraction methods.
| Solvent | ABTS radical scavenging activity, % of control1) | ||||
| Concentration (mg/mL)2) | |||||
| 1 | 2.5 | 5 | 10 | 20 | |
| Hot water | 14.09±0.29d | 21.33±0.89c | 38.66±0.41c | 65.74±0.37d | 83.99±0.96c |
| EtOH 100% | 24.11±0.20a | 34.50±0.21a | 48.95±0.26a | 85.17±0.50a | 97.17±0.32a |
| EtOH 70% | 21.05±0.28b | 30.92±0.71b | 43.06±0.21b | 83.54±0.26b | 91.80±0.95b |
| EtOH 50% | 15.64±0.37c | 31.61±0.35b | 43.06±0.44b | 79.75±0.59c | 92.16±0.29b |
아질산염 소거능
pH 1.2, 4.2, 6.0에서의 일반메밀잎 열수 추출물과 에탄올 추출물의 아질산염 소거능은 pH에 따라 큰 차이를 보였다(Table 4). 반응 용액이 pH 1.2의 경우에 가장 높은 소거 활성을 보였으며, pH가 증가함에 따라 활성이 감소하는 경향을 나타냈다.
Table 4.
Nitrite radical scavenging activity of extracts obtained using different extraction methods.
| Solvent | Nitrite scavenging activity(%)1) | ||
| pH 1.2 | pH 4.2 | pH 6.0 | |
| Hot water2) | 68.12±2.13a | 42.35±0.73a | ND |
| EtOH 100%2) | 71.09±1.57a | 43.92±0.20a | ND |
| EtOH 70%2) | 66.20±3.12a | 37.58±0.96b | ND |
| EtOH 50%2) | 51.68±1.50b | 30.09±0.17d | ND |
pH 1.2에서 에탄올 100% 추출물이 71.09±1.57%로 가장 높은 활성을 보였으며, 열수 추출물(68.12±2.13%)과 에탄올 70% 추출물(66.20±3.12%)이 그 뒤를 이었다. 에탄올 50% 추출물은 51.68±1.50%로 가장 낮은 활성을 나타냈다.
pH 4.2에서는 아질산염 소거 활성이 전반적으로 감소했지만, 여전히 30% 이상의 활성이 유지되었고, pH 6.0에서는 모든 추출물에서 아질산염 소거 활성이 검출되지 않았다. 이러한 결과는 메밀잎 추출물이 산성 조건에서 더 효과적으로 아질산염을 소거함을 시사한다. 또한, 에탄올 농도가 높을수록 아질산염 소거 활성이 증가하는 경향을 보였다. 더덕 뿌리 추출물에서 에탄올의 농도가 100%에서 가장 낮은 활성을 보인 Boo et al. (2016)의 연구와는 상이한 결과를 보였으며 비타민나무 잎을 에탄올 100%에 추출한 경우 가장 높은 아질산염 소거 활성을 나타냈고 40, 80% 에탄올 추출물순으로 높았다는 Park and Joo (2021)의 연구와는 100% 에탄올 추출물이 가장 높은 소거 활성을 보인 본 연구결과와 일치하였으나, 50% 에탄올 추출물이 70% 에탄올 추출물보다 낮은 활성을 나타낸 결과와 약간의 차이를 보였다.
세포 생존율 측정(MTT assay)
에탄올 농도를 달리한 에탄올추출과 열수추출에서의 세포독성 효과를 측정하고자 일반메밀잎 추출물의 농도를 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml, 400 ug/ml, 800 ug/ml로 달리하여 세포 생존율을 측정하였다(Table 5). 일반메밀잎의 추출용매별 세포독성 효과에서, RAW 264.7 세포의 생존율은 열수추출과 에탄올추출 모두에서 50, 100, 200, 400, 800 ug/ml 모든 농도에서 80% 이상으로 대식세포인 RAW 264.7 세포에 대해 독성이 거의 없는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 에탄올 농도에 따라 세포생존율에는 큰 차이가 없음을 알 수 있었다.
Table 5.
Effect of common buckwheat leaf extracts on cell viability in RAW 264.7 cells.
| Solvent | Cell viability (% of control)1) | ||||
| Concentration (ug/mL)2) | |||||
| 50 | 100 | 200 | 400 | 800 | |
| Hot water | 96.28±2.17a | 92.17±2.64a | 88.88±2.40a | 82.84±2.52a | 83.34±5.96a |
| EtOH 100% | 88.06±3.62a | 86.84±0.75ab | 83.44±1.90a | 82.85±2.85a | 80.36±4.25a |
| EtOH 70% | 94.29±4.37a | 95.58±3.60ab | 85.57±3.80a | 85.82±3.48a | 82.80±0.64a |
| EtOH 50% | 97.86±4.11a | 93.59±0.82b | 87.92±3.11a | 83.03±4.59a | 81.25±4.47a |
NO 생성 및 Cytokine 억제 효과
에탄올 농도를 달리한 에탄올추출과 열수추출에서의 NO의 생성을 측정하였다. 메밀잎 추출물의 농도를 50, 100, 200 ug/ml로 전처리 후에 LPS 처리된 실험구에서의 NO 생성을 측정한 결과 열수추출물이 비해 에탄올 추출물에서 NO 생성이 더 억제되었으며, 농도가 높을수록 대식세포에서의 NO 생성이 감소함을 보여 농도의존적으로 NO 생성을 유의하게 억제함을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
NO(nitric oxide)는 염증 반응에서 중요한 역할을 하는 물질로, 과도한 NO 생성은 염증성 질환을 악화시킬 수 있다. Cytokines(IL-1β, IL-6, TNF-α)는 면역 세포에서 분비되는 단백질로, 염증 반응을 조절하는 역할을 한다.
이러한 결과는 활성화된 설치류 RAW 264.7 대식세포에서 당귀 에탄올 추출물의 항염증 효과는 추출물의 농도에 의존적으로 NO 생산량이 현저히 감소되는 경향을 보인 Jang et al. (2002)의 연구와 쇠비름의 물과 에탄올 추출물에서의 항염증 활성은 열수추출물보다 에탄올 추출물(100% 에탄올)에서 높았다는 Kim et al. (2018)의 연구와 일치하였다.
Cytokines IL-1β, IL-6, TNF-α 반응을 확인한 결과, 메밀잎 추출물은 Cytokines 분비를 감소시키는 효과가 있었으며, 유의미한 항염증 활성을 나타냈다(Figs. 2, 3, 4). 이러한 항염증 활성은 열수추출물보다 에탄올 추출물 100%, 70%, 50%에서 높았으며, 특히 100% 에탄올 추출물에서 다른 추출물보다는 다소 높게 나타났다.
LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 IL-1β 생성량에 대한 메밀잎 추출물의 억제 효과는 모든 추출물이 대조군에 비해 IL-1β 생성을 유의미하게 감소시켰다(p<0.05). 특히, 에탄올 추출물(100%, 70%, 50%)은 열수 추출물보다 더 강력한 억제 효과를 나타냈으며, 이 중 100% 에탄올 추출물이 가장 높은 억제 효과를 보였다.
IL-6 생성량을 측정한 결과, 에탄올 추출물이 농도 의존적으로 IL-6 생성을 억제하는 경향을 보였다. 100% 에탄올 추출물이 가장 강력한 억제 효과를 나타냈으며, 70%와 50% 에탄올순으로 억제되었던 반면, 열수 추출물의 억제 효과는 상대적으로 낮았다. TNF-α 생성량은 IL-1β 및 IL-6와 마찬가지로 에탄올 추출물이 유의미하게 감소시켰다(p<0.05). 특히, 100% 에탄올 추출물이 가장 높은 억제 효과를 보였으며, 70%와 50% 에탄올 추출물 또한 열수 추출물보다 양호한 억제 효과를 나타냈다.
본 연구 결과 메밀잎 추출물이 염증 매개인자인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 생성을 억제함으로써 항염증 활성을 가진다는 것이 확인되었다. 특히, 에탄올 기반의 추출물이 열수 추출물보다 더 높은 억제 효과를 보였으며, 이는 Oh (2022)의 개똥쑥 연구와 유사한 경향을 나타낸다. Oh (2022)는 개똥쑥의 70% 에탄올 추출물이 TNF-α를 현저히 감소시키고 IL-1β는 약간 억제한다고 보고하였는데, 본 연구에서도 메밀잎의 70% 에탄올 추출물이 TNF-α 및 IL-1β 모두에서 열수 추출물보다 우수한 억제 효과를 보였다. 이러한 결과는 에탄올 추출이 염증 매개인자 억제에 더 적합하다는 점을 시사한다.
Tyrisonase 활성 저해효과의 측정
일반메밀잎 추출물을 다양한 추출 용매로 추출하였을 때 Tyrosinase 활성 억제 효과를 나타냈다(Fig. 5).
멜라닌은 피부색을 결정하는 주요 색소이며, 과도한 멜라닌 생성은 기미, 주근깨 등의 피부 문제를 유발할 수 있다. Tyrosinase는 멜라닌 생성 과정에서 핵심적인 역할을 하는 효소로, tyrosinase 활성 억제는 미백 효과를 얻기 위한 중요한 전략 중 하나이다. Tyrosinase는 멜라닌 생성에 관여하는 효소로, Tyrosinase 활성을 억제하면 미백효과를 기대할 수 있다(Hearing and Jiménez, 1987; Flurkey, 1991). 본 연구 결과 메밀잎 추출물은 열수 추출물에서 에탄올 추출물보다 높은 tyrosinase 저해 활성을 나타냈으며, 에탄올 추출용매가 농도가 낮을수록 tyrosinase 활성이 더 높아지는 경향을 보였다. 일반메밀 및 쓴메밀 추출물이 Tyrosinase 활성을 억제하여 미백 효과를 나타낼 수 있음이 보고된 바 있다(Han et al., 2014). 그러나 본 연구에서는 에탄올 농도가 낮을수록 Tyrosinase 활성이 높아지는 특이한 경향을 보였다. 따라서 일반 메밀의 미백 효과를 극대화하기 위해서는 추출 용매의 농도를 최적화하는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
적 요
본 연구는 열수추출을 이용하고, 에탄올 추출법에서의 에탄올 농도를 달리하여 일반메밀 잎의 항산화 효과를 분석함으로써 일반메밀잎 항산화 물질 추출에 적합한 추출법을 구명하였다.
1.추출용매를 달리한 일반메밀잎의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 에탄올 추출물 100%에서 총 폴리페놀 함량이 297.35 mg/g, 총 플라보노이드 함량이 209.56 mg/mg으로 가장 높았다.
2.추출용매를 달리한 일반메밀잎의 DPPH 라디칼 소거능은 에탄올 100% 추출물에서 추출물의 농도가 10 mg/ml에서 97.23%로 가장 높았으며, 농도 의존적인 경향이었다.
3.추출용매를 달리한 일반메밀잎의 ABTS 라디칼 소거능은 에탄올 100% 추출물에서 추출물의 농도가 20 mg/ml에서 97.17%로 가장 높았으며, 에탄올의 농도가 증가할수록 증가하는 농도의존적 경향이었다.
4.일반메밀잎의 아질산염 소거능은 pH 1.2에서 에탄올 100% 추출물에서 65.94%로 가장 높았으며, 반응 용액의 pH가 증가함에 따라 활성도는 감소하는 경향이었다.
5.NO 생성에서는 메밀잎 추출물은 열수추출물 비해 에탄올 추출물에서 NO 생성이 더 억제되었으며, 농도가 높을수록 대식세포에서의 NO 생성이 증가함을 보여 농도 의존적으로 NO 생성을 유의하게 억제함을 확인할 수 있었다.
6.추출용매를 달리한 일반메밀잎에서의 Cytokines IL-1β, IL-6 및 TNF-α 반응을 보았는데 일반메밀잎 추출물은 Cytokines 분비에 감소시키는 영향을 미치고 있으며 유의한 항염증 활성을 나타냈다. 이러한 항염증 활성은 열수추출물보다 에탄올 추출물 100%, 70%, 50%에서 높았으며, 특히 100% EtOH 추출물에서 다른 열수추출물과 에탄올 70%, 50% 추출물보다는 다소 높게 나타났다.
7.일반메밀잎에서의 추출용매별 Tyrisonase 활성 저해효과의 측정을 하였는데 에탄올 추출용매가 농도가 낮을수록 tyrosinase 활성이 더 높아지는 경향을 보여 Tyrisonase 활성 저해효과는 추출용매별 특이적 특성을 보였다.
