옥수수수염의 채취 및 에탄올 추출

본 연구에 사용된 옥수수수염은 농촌진흥청 국립식량과 학원에서 육성된 ‘광평옥’을 2013년 농촌진흥청 국립식량 과학원 밭작물 시험포장에서 재배한 후 채취하여 사용하였 다. 옥수수수염이 이삭에서 출사하기 이전에 실크백(silk bag) 으로 처리하여 화분을 수분하지 못하도록 하고, 출사후 3일 이 경과된 미수정된 옥수수수염을 채취하여 사용하였다. 옥 수수수염은 채취 즉시 약 5~10 cm의 크기로 세절하여 옥수 수수염 1 kg 당 prethanol A (C₂H₅OH, Duksan, Korea) 2,000 mL을 가한 후 4°C, 15°C 및 25°C (상온)에서 보관하 면서 추출시간의 경과에 따른 플라보노이드 및 페놀성 물질 의 추출효율을 검토하였다. 추출이 완료된 prethanol A 추 출물은 Whatman No. 3 여과지로 여과 후 감압농축을 하였 으며 이때 수조의 온도는 40°C, 환류냉각수의 온도를 4°C 로 조절하여 옥수수수염 추출액의 농축물을 얻었다.

엽록소, 지질 및 당질의 제거

농축된 옥수수수염 추출물에 다량 함유된 엽록소, 지질 및 당질을 제거시키기 위해 농축된 추출물 약 100 mL 당 methylene chloride (CH₂Cl₂) 약 150 mL을 가하여 2회에 걸쳐 분액 후 현탁액(slurry) 상태로 농축하고 무수에탄올 (absolute ethanol)을 가하여 플라보노이드 및 페놀성 물질 등 유효물질들을 3회에 걸쳐 용출시킨 후 혼합하여 감압농 축기로 완전히 건조시켰다.

Preparative C₁₈ column에 의한 추출물의 분리 및 흡광 도 측정

엽록소, 지질 및 당질이 제거된 추출물은 감압농축시킨 후 농축물 약 50 g 당 ethanol 약 200 mL을 가하여 추출물을 완전히 용해시켜 preparative C₁₈ column chromatography (Büchi, Newcastle, DE)에 주입하여 옥수수수염 추출물에 함유된 플라보노이드 및 페놀성 물질을 분리하였다. 이때 사용된 column cartridge는 40 × 150 mm의 크기로서 120 g 의 preparative RP-C₁₈ bulk packing material, 125Å 55-105 μm (Waters, Milford, MA) 분말을 vacuum V-700 pump (Büchi, Newcastle, DE)와 N₂ gas로 충진하여 column을 제조하였 다. 옥수수수염 추출물 분리에 사용된 이동상은 초순수와 HPLC용 ethanol을 사용하였으며 C₁₈ column cartridge에 20 mL의 추출물을 주입하고, 초순수 100%의 초기조성에 서 에탄올 100%로 된 기울기법의 이동상 용매를 분당 20 mL의 유속으로 70분간 흘려주었다. 이때 UV-detector (Büchi UV photometer C-635)의 파장은 352 nm, 분취기의 fraction 은 시험관 당 20 mL가 되도록 조절하여 옥수수수염 추출물 로부터 분취물 I, II, III 및 IV를 각각 분리하였다. 분리된 옥수수수염 에탄올 추출물의 분취물 I, II, III, IV의 흡광도 확인은 UV/Vis spectrophotometer (U-2900, Hitachi, Japan) 를 사용하여 측정하였다.

Micro Q-TOF mass를 이용한 분취물의 분자량(m/z) 확인

Preparative C₁₈ column chromatography로 분리된 옥수수 수염 추출물의 분취물 I, II, III 및 IV에 포함된 flavonoids의 분자량(molecular weight) 확인을 위해 사용된 질량분석기 는 micro Q-TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics Inc, Germany)로서 질량분석 조건은 1) source: ESI, 2) capillary: 4500 V, 3) neubulizer gas: 0.8 bar N₂, 4) dry gas: 7 L/min N₂, 5) dry temperature: 200°C이었다. 이 때 사용된 HPLC 는 Dionex Ultimate 3000 (Dionex, German)이었고, XTerra MS C₁₈ column (Waters, 5 μm, 150 × 2.1 mm)을 사용하여 0.1% formic acid를 포함한 10% ethanol 용액 80% (A)와 0.1% formic acid를 포함한 100% ethanol용액 (B)의 20% 초기조성에서 100% ethanol의 비율이 80%가 될 때 까지 47분간 H₂O/EtOH linear gradient 하였으며 column으로부 터 분리된 flavonoids는 UV 352 nm로 측정하였다(Kim et al., 2000).

옥수수수염의 채취 및 에탄올 추출물 제조

옥수수수염이 이삭에서 출사하기 이전에 실크백(silk bag) 을 처리하면 옥수수수염이 출사하여도 화분의 수분 및 수정 이 차단되어 수염이 지속적으로 길이 신장을 하게 되는데, 본 시험에서는 출사 후 3일이 경과되어 15 cm 이상 자라난 옥수수수염을 실크백을 제거하고 채취하였다. Fig. 1은 실 크백(silk bag)을 씌워 화분이 수분되지 않은 옥수수수염과 방임수분(수정) 시킨 옥수수수염의 메이신 함량의 변화를 출사 후 일수 경과에 따라 나타낸 것이다. 그림에서 보는 바 와 같이 화분이 수분되지 않은 옥수수수염의 메이신 함량은 출사 후 3일에 최대치에 도달하고, 그 후 감소되는 것으로 나타났으며, 방임수분된 옥수수수염의 메이신 함량은 출사 후 지속적으로 감소되는 것으로 나타나 화분의 수분 여부에 따라 메이신 함량에 많은 차이가 있음을 알 수 있었다.

Fig. 1.

Changes on maysin content in silks of Kwangpyeongok according to days after silking.

출사한 옥수수수염을 인위적으로 절단시키면 절단된 부 위가 신속히 갈색 또는 흑갈색으로 변하는 현상을 흔히 관 찰할 수 있는데, 이와 같은 현상은 polyphenol성 물질인 dihydroxy flavone이 효소적 산화에 의하여 O-quinone을 생 성시켜 단백질과 결합되어 갈변화 되기 때문이라고 한다 (Levings & Stuber, 1971; Widstrom et al., 1992). 절단된 옥수수수염의 갈변화 반응에는 luteolin의 유도체인 5, 7, 3’, 4’-tetrahydroxyflavone 계열의 물질들이 관여하며 이들을 가수분해하면 C-glycosylflavone과 luteolin 7-O-glycoside 가 검출되는데, 이와 같은 flavonoid 계열의 물질을 함유하 고 있지 않은 계통들의 옥수수수염은 절단되어도 갈변되지 않으며 이들은 열성유전자에 의해 합성이 조절되는 luteolin 이 결핍되어 있다고 한다(Byrne et al., 1996; Levings Levings & Stuber, 1971). Kim et al. (2000)은 luteolin 6-C--glycoside 인 maysin 및 apimaysin의 함량이 낮은 계통들은 옥수수수 염을 절단하여도 갈변화 반응이 미약하였는데, 이는 옥수수 수염의 갈변화 반응에 maysin 및 apimaysin 등이 관여하기 때문이며 옥수수수염을 절단하여 갈변화 정도를 판단하여 maysin 고 함유 계통선발에 응용할 수 있다고 하였다.

Kim et al. (2000)은 옥수수수염에 함유된 메이신 함량은 출사 후 3~4일경 최대에 달하고 그 이후에 감소되는데, 그 원인으로 옥수수수염은 출사 후 3일 이내에 화분의 수분 및 수정이 완료되어 길이 신장이 정지되고 급격히 위조되기 때 문이라 하였다. 본 시험에서도 옥수수 이삭에서 수염이 출 사하기 이전에 실크백을 처리하여 화분의 수분을 인위적으 로 차단시켜 옥수수수염의 신장을 유도함과 동시에 메이신 함량이 최고에 도달한 시기에 옥수수수염을 채취하는 것이 효과적인 방법임을 확인할 수 있었다. 따라서 지금까지 얻 어진 결과를 종합적으로 고려할 때 미수정 옥수수수염은 출 사 후 2~7일까지 메이신 함량이 높은 옥수수수염의 채취가 가능할 것으로 판단되었고, 화분이 수분(수정)된 옥수수수 염의 경우에는 출사 후 2~5일까지 옥수수수염의 채취가 가 능한 것으로 나타났으나 수정된 옥수수수염의 메이신 함량 은 급격한 감소를 보이기 때문에 메이신 등 flavonoid 계열 의 물질의 추출을 위해서는 미수정된 옥수수수염을 사용하 는 것이 보다 효율적인 것으로 판단되었다.

Fig. 2는 출사 후 3일이 경과된 미수정된 옥수수수염을 채취하여 약 5~10 cm의 크기로 세절하여 옥수수수염 약 1 kg 당 에탄올(prethanol A) 약 2,000 mL을 가한 후 4°C, 1 5°C 및 25°C (상온)에서 보관하였을 때 추출시간의 경과에 따른 플라보노이드 및 페놀성 물질의 추출효율을 메이신 함 량의 변화로 나타낸 것이다.

Fig. 2.

Comparison of extraction efficiency of maysin from silks of Kwangpyeongok under different temperature conditions.

채취한 옥수수수염에 추출용 에탄올을 가한 후 보관 온도 에 따른 플라보노이드 및 페놀성 물질의 추출시간은 25°C (상온)가 4°C 및 15°C에 비해 다소 추출시간이 단축되는 것 으로 나타났으나, 25°C의 상온조건은 온도변화가 다소 크 고 직사광선에 노출되어 변질의 우려가 있는 반면 15°C 이 하의 저온조건은 저장성은 높으나 플라보노이드 및 페놀성 물질의 추출효율이 상온에 비해 다소 낮은 것으로 나타났다.

따라서 본 시험에서 얻어진 결과를 종합적으로 고려할 때 상온 또는 저온에서 추출 하기 위해서는 최소 6일 이상 저 장하면서 추출을 하는 것이 바람직할 것으로 판단되었는데, 보다 구체적으로는 에탄올을 가한 옥수수수염을 15~25°C 에서 추출할 경우 6~15일, 4°C에서 추출할 경우에는 6~30 일간 보관시 플라보노이드 및 페놀성 물질의 변화를 최소화 시킬 수 있을 것으로 판단되었다.

옥수수수염 에탄올 추출물의 분리

Fig. 3은 감압 농축된 옥수수수염 조추출물을 분취용 크 로마토그래피(flash chromatography, Buchi, Newcastle, DE) 의 C₁₈ 컬럼에 적재하여 70분간 기울기법으로 이동상용매를 흘려서 수거된 옥수수수염 추출물의 크로마토그램(chromatogram) 을 나타낸 것이다. 본 시험의 결과 40 × 150mm 크기의 column cartridge 충진에 사용된 preparative RP-C₁₈ reverse phase bulk packing material의 양은 100~130 g의 범위가 가장 적 절한 것으로 나타났는데(결과 미제시), 충진제의 양을 110 g 미만으로 충진할 경우 분리능이 현격히 저하되고, 충진제의 양을 130 g 이상으로 충진 할 경우에는 분취용 크로마토그 래피 시스템 pump의 압력이 높아지고 물질분리에 소요되 는 시간이 길어지는 단점이 있는 것으로 나타났다. 따라서 120 g 내외의 C₁₈ 분말로 충진시킨 column cartridge를 이 용하여 옥수수수염 추출물을 분리시켰을 때 그림에서 보는 바와 같이 옥수수수염 조추출물은 RT (retention time)가 450~690초에서 분취물 I이 분리되었고, RT 1,690~1,880초 에 분취물 II, RT 1,881~2,120초에 분취물 III, RT 2,600~ 3,000초에 분취물 IV가 각각 분리되었다.

Fig. 3.

Isolation of four fractions from ethanolic extract of Kwangpyeongok silks by flash chromatography. Fractionation was performed on a flash column cartridge (150 × 40 mm i.d.) packed with a preparative RP-C₁₈ bulk packing material (125 Å, 55-105 μm), and monitored at 352 nm.

C₁₈ 컬럼 분취물의 흡광도 측정

Fig. 4-a~4-e는 분취용 크로마토그래피 C₁₈ 컬럼으로 분리 된 분취물 I, II, III, IV에 대하여 UV/Vis spectrophotometer (U-2900, Hitachi, Japan)를 사용하여 분취물의 흡광도를 확 인한 결과를 나타낸 것이다.

천연물의 특성을 검토하고자 할 때 일반적으로 대상물질 의 흡광도를 측정하는 absorption spectroscopy법이 널리 이 용되고 있는데, 흡광도 측정법은 시료가 소량일지라도 분석 이 가능하고, 간단한 조작으로 목적 물질에 대한 유용한 정 보를 얻을 수 있으며, UV/Vis spectrophotometer와 같은 비 교적 간단한 분석장비가 사용된다는 점에서 많은 이점이 있 다(Andersen & Markham, 2006).

얻어진 분취물들의 흡광도를 분석한 결과 분취물 I은 327 nm 및 239 nm에서 최대 흡광도(λ_max)를 나타었고, 300~ 320 nm 부근에서 특유한 shoulder를 보여(Fig. 4a) 분취물 I가 phenol성 계열의 물질임을 알 수 있었다. 분취물 II의 최대 흡광도(λ_max)는 339 nm 및 274 nm (Fig. 4b), 분취물 III의 λ_max는 345 nm 및 277 nm (Fig. 4c)를 나타내 분취물 II와 III은 전형적인 flavonoid 계열의 물질임을 알 수 있었 고, 분취물 Ⅳ의 최대 흡광도는 352 nm, 270 nm, 257 nm 에서 λ_max를 나타내었으며, 255~270 nm 부근에서 특유한 shoulder를 보여(Fig. 4d) 분취물 IV는 flavonoid A환에 hydroxy group이 2개이상 존재하는 전형적인 flavonoid 계열의 물질 임을 알 수 있었다(Andersen & Markham, 2006; Harborne & Baxter, 1999)

Fig. 4.

Absorption spectra of fraction-I, -II, -III, and -IV isolated from ethanolic extract of Kwangpyeongok silks.

C₁₈ 컬럼 분취물의 분자량(m/z) 확인

Table 1과 Fig. 5~8은 micro TOF-Q II 분석을 통하여 분 취물 I, II, III 및 IV의 질량(mass)값을 분석한 결과를 나타 낸 것이다.

Fig. 5는 분취용 크로마토그래피 C₁₈ 컬럼으로 분리된 분 취물 I의 HPLC 크로마토그램 및 micro TOF-Q II에 의한 분자량(m/z)을 분석한 결과를 나타낸 것으로, mass spectrometry 분석 결과 분취물 I을 구성하고 있는 주요물질이 m/z 355 [M+H]⁺인 3-(3,4-dihydroxycinnamoyl)quinic acid로서 chlorogenic acid (C₁₆H₁₈O₉) 임을 확인하였다. Chlorogenic acid는 caffeic acid와 quinic acid의 에스테르 결합으로 형성된 polyphenol 화합물로 각종 식물 등에 많이 함유되어 있으며 산화적인 손상으로 야기되는 암이나 심혈관 질병을 예방할 수 있는 물질로서(Rice-Evans et al., 1996), 생체 내에서 항산화 작 용, 과산화지질의 생성 억제효과, 콜레스테롤 생합성 억제 효과 및 메탈이온의 착화합화 등이 보고되었다(Chen & Ho, 1997).

Fig. 5.

ESI micro Q-TOF mass spectrometer analysis for fraction-I isolated from ethanolic extract of Kwangpyeongok silks.

Fig. 6 및 7은 분취용 크로마토그래피 C₁₈ 컬럼으로 분리 된 분취물 II 및 III의 HPLC 크로마토그램 및 분자량을 분 석한 결과를 나타낸 것이다. Mass spectrometry 분석 결과 분취물 II을 구성하고 있는 주요물질이 chlorogenic acid 및 m/z 653 [M+H]⁺인 luteolin 3'-methyl ether 7-glucuronosyl- (1→2)-glucuronide (C₂₈H₂₈O₁₈)로 구성된 혼합물임을 확인 하였고, 분취물 III를 구성하고 있는 주요물질은 chlorogenic acid, luteolin 7-O-neohesperidoside (m/z 595 [M+H]⁺, C₂₇H₃₀O₁₅) 및 luteolin 3'-methyl ether 7-glucuronosyl-(1→2)-glucuronide (m/z 653 [M+H]⁺)로 구성된 혼합물임을 각각 확인하였다.

Fig. 6.

ESI micro Q-TOF mass spectrometer analysis for fraction-II isolated from ethanolic extract of Kwangpyeongok silks.

Fig. 7.

ESI micro Q-TOF mass spectrometer analysis for fraction-III isolated from ethanolic extract of Kwangpyeongok silks.

옥수수수염 추출물에 포함되는 flavonoid 계열의 물질 중 luteolin 7-O-neohesperidoside는 Veronicastrum sibiricum, Lonicera gracilipes, Hedwigia ciliata 등의 식물에서 보고 (Österdahl, 1979, Kikuchi & Matsuda, 1996)된 바 있는 flavonoid O-glycoside 계열의 물질로서 항산화작용 및 항 균효과가 있는 것으로 알려져 있으며, luteolin 3'-methyl ether 7-glucuronosyl-(1->2)-glucuronide는 luteolin-7-O-glucuronide 계열에 속하는 물질로서 본 연구를 통하여 옥수수수염에 함 유되어 있음을 처음으로 확인할 수 있었는데, 지금까지 그 기능에 대해 알려진 바가 별로 없어(Harborne & Baxter, 1999; Mues, 1983) 앞으로 이들 물질과 관련된 연구가 보 다 구체적으로 이루어져야 할 것으로 판단되었다.

Fig. 8은 분취용 크로마토그래피 C₁₈ 컬럼으로 분리된 분 취물 Ⅳ의 HPLC 크로마토그램 및 mass spectrometry 분석 결과를 나타낸 것으로, 분취물 IV는 m/z 577 [M+H]⁺인 2''-O-α-L-rhamnosyl-6-C--(6-deoxy-xylO-hexose-4-ulosyl) luteolin로서 분리된 물질이 maysin (C₂₇H₂₈O₁₄) 임을 확인 하였다.

Fig. 8.

ESI micro Q-TOF mass spectrometer analysis for fraction-IV isolated from ethanolic extract of Kwangpyeongok silks.

최근 Choi et al. (2014)은 신경세포의 사멸에 대한 옥수 수수염 유래 메이신의 세포 사멸 저해 활성을 알아보기 위 해 human neuroblastoma cell line (SK-N-MC)을 2시간동 안 5~50 μg/ml 농도로 처리하고, H₂O₂ 200 uM 농도로 24 시간 동안 반응시킨 후 MTT assay를 통해 cell viability를 측정한 결과 세포생존율이 유의적으로 증가하였다고 하였 으며, apoptotic cell death와 DNA fragmentation이 감소함 을 확인하였다. 또한 세포내 ROS의 생성량이 줄었고, 항산 화효소들인 CAT, GPx-1, SOD-1,-2, HO-1의 mRNA level 을 증가시켜줌으로써 H₂O₂에 의해 유발된 산화 스트레스에 대한 억제효과가 있음을 확인한 바 있다. 또한 Lee et al. (2014)은 활성화된 murine RAW 264.7 대식세포(macrophages) 에서 옥수수수염에서 분리한 메이신이 면역자극활성(immunostimulating activity)을 통한 면역조절 효과(immunomodulatory effect) 및 자연 면역활성(innate immunity activity)을 증진 시키는 효과가 있음을 보고하였다.

본 연구의 결과 얻어진 옥수수수염의 알코올 추출물로부 터 분리된 분취물 I, II, III 및 IV를 감압농축기로 농축하여 분취물 분말을 얻었는데, 분취물 I은 옥수수수염 생체 100 g 당(수분함량 약 92%) chlorogenic acid 35 mg/100 g, 분 취물 II는 chlorogenic acid 및 luteolin 3'-methyl ether 7- glucuronosyl-(1→2)-glucuronide를 함유한 혼합물로 48 mg/100 g, 분취물 III는 chlorogenic acid, luteolin 7-O-neohesperidoside 및 luteolin 3'-methyl ether 7-glucuronosyl-(1→2)-glucuronide를 함유한 혼합물로 46 mg/100 g, 분취물 IV는 maysin 138 mg/100 g을 얻을 수 있었다.