양파(Allium cepa L.)는 음식의 맛과 향을 내는 재료로 세 계적으로 많이 소비되고 있을 뿐만 아니라 기능성이 높은 채소로 인식되어 전 세계에서 재배되고 있다. 식재료 사용 후 발생하는 껍질과 뿌리는 부산물로서 가축의 사료로서 이 용함으로서 경제적인 중요성도 증가하고 있다(Jeon et al., 2012; Mogren et al., 2007).
양파에는 대표적으로 황을 함유하고 있는 allicin의 그 유 도체들과 flavonol 등 인체에 유익한 기능성분을 다량 함유 하고 있는 것으로 알려져 있다(Perez-Gregorio et al., 2010; Xiao et al., 2002). 특히 양파의 flavonol은 quercetin 배당 체로서, quercetin 3,4'-O-diglucoside (Q34'diG) 및 quercetin 4'-O-glucoside (Q4'G)가 주요 성분으로 보고되어 있으며, isorhamnetin glucosides, kaempferol glucosides가 미량 함유 되어 있는 것으로 알려져 있다(Bonaccorsi et al., 2005; Bonaccorsi et al., 2008; Park & Lee 1996).
Quercetin은 flavonoid류에 속하는 식물 이차대사산물로 과일, 채소 등 다양한 식물에 함유되어 있다. 양파 내 quercetin 함량은 가식부위에서 겉껍질로 갈수록 증가하며(Gennaro et al., 2002; Skerget et al., 2009), 이러한 quercetin은 자유기 라디칼 소거활성 뿐만 아니라, 심혈관질환, 위암 예방, 혈행 개선 등 생리활성을 나타낸다고 보고되어 있다(Clifton 2004; Yoshida 1990; Hwang et al., 2003; Chung et al., 2011). 특 히 quercetin은 메밀에 주로 함유되어 있는 rutin보다도 높 은 생리활성을 나타낸다고 보고하였다(Manach et al., 1997). 국내에서도 양파 내 quercetin의 활성이 알려지면서 quercetin 의 분리기술 개발 및 최적 추출조건을 찾고 있으며, 항산화 및 항암 등 각종 생리활성 연구 등 다양한 방법으로 접근하 여 연구하고 있다(Fossen et al., 1998). 그러나 국내외 양파 유전자원에 대해 mass spectrometry 기술을 이용, flavonol 배당체를 정성 분석하고 이들의 함량을 평가하여 비교한 연 구는 아직까지 상대적으로 적은 편이다.
따라서 본 연구에서는 다양한 양파 유전자원별 flavonol 배당체의 조성 및 함량을 분석하여 이들의 고함유 품종 개 발을 위한 기초 자료로 활용하고자 하였다.
재료 및 방법
공시 재료
농촌진흥청 국립농업과학원 유전자원센터로부터 양파 유 전자원 75점(흰색 62점, 자색 13점)을 분양받았다. 분석전 시료로 사용하기 위해 모든 유전자원은 동결건조한 후 믹서 기로 곱게 분말화하였다.
시약 및 기기
Acetonitrile, methanol (MeOH) 및 water는 Fisher Scientific (HPLC grade) (Fair Lawn, NJ, USA)를 사용하였으며, formic acid는 Junsei Chemical Co., Ltd. (Kyoto, Japan)를 사용하 였다. 전처리 과정 중에 발생하는 산화를 방지하기 위해 tertbutylhydroquinone (TBHQ) (Sigma Aldrich; St. Louis, MO, USA)를 사용하였으며, quercetin 표준품은 Extrasynthèse (Genay, France)를 사용하였다. 정성 및 정량을 위해 2998 photodiode array detector (PDA)가 장착된 Alliance e2695 HPLC system (Waters Co., Milford, MA, USA) 및 Mircomass ZQ MS (Waters Co., Milford, MA, USA)를 사용하였다.
Flavonol 추출
건조분말시료 0.1 g을 15 mL cornical tube에 담아 tertbutylhydroquinone (TBHQ, 1 g/2 L)가 함유된 추출용매 [methanol:formic acid:water=50:5:45(v/v/v)] 5 mL을 넣었 다. 충분히 진동혼합(vortex)하여 20분간 초음파추출(sonication) 한 다음 원심분리(3500 rpm, 4°C, 10 min)하였다. 상층액을 취하여 0.45 μm PTFE hydrophilic syringe filter로 여과한 후 HPLC 분석용 갈색 vial에 담았다. 상기 추출과정을 2회 더 반복하여 여과 총액을 분석 시료로 사용하였다.
HPLC 및 LC-MS 분석방법
분석 컬럼은 Phenomenex Luna 5 μ C18 100A (250 × 4.6 mm, i.d., 5 μm) (Phenomenex, Torrance, CA, USA)를 사 용하였다. 컬럼 오븐 온도는 45°C로 설정하였으며, 시료 주 입량은 20 μL, 검출파장은 210-600 nm (대표파장 360 nm) 로 하였다. 이동상으로는 용매A (0.3% formic acid)와 용매 B (acetonitrile)를 사용하였고, 유량은 1.0 mL/min로 하였다. 용매 구배조건은 B를 20%로 시작하여 25분까지 일정하게 60%로 증가시켰으며, 25.1까지 0.1분 동안 100%로 급격하 게 증가시켰다. 다시 30분까지 60%로 감소시키고 30.1분까 지 0.1분 동안 20%로 급격하게 감소시켰으며, 35분까지 20% 를 유지하였다. 시료 중 각 성분의 면적은 relative response factors (RRF)를 고려하지 않고 표준품인 quercetin의 면적을 이 용하여 상대적으로 정량(mg/g dry weight, DW)하였다. Flavonol 배당체를 동정하기 위한 MS 분석조건은 cone voltage 30 V, source temperature 120°C, desolvation temperature 500°C, N2 가스 1020 L/h이었으며, 분자량 측정 범위는 m/z 200-1200 로 설정하였다.
결과 및 고찰
양파 유전자원으로부터 flavonol 배당체의 분리 및 동정
Table 1에서 알 수 있듯이, 흰색 및 자색 양파 유전자원으 로부터 총 5종의 flavonol 배당체(quercetin 3,4'-diglucoside, Q34'diG; quercetin 3-glucoside, Q3G; quercetin 4'-glucoside, Q4'G; isorhamnetin 4'-glucoside, I4'G; quercetin, Q) 개별 성분을 분리하였고, LC-ESI-MS 분석을 통하여 동정하였다 (Bonaccorsi et al., 2005). 각 개별 성분의 피크 머무름 시간 은 15분 이내로 모두 확인되어 분석시간이 비교적 짧아 다 수 유전자원 분석시 효율적이었으며, 주요 성분은 Q34'diG 및 Q4'G임이 확인되었다(Fig. 1). 심혈관질환, 항암 등 다양 한 생리활성을 나타내는 quercetin은 식물체 내에서는 주로 더 안정한 형태인 aglycone의 배당체로 존재 한다고 알려져 있다(Yoshida 1990; Erlund et al., 2000). 따라서 흰색 및 자색 양파로부터 검출된 주성분은 quercetin 배당체로서 좀 더 안정적인 형태로 존재함을 알 수 있었다.
Table 1.
Mass spectrometric data of flavonol glycosides identified from onion accessions.
Flavonol 배당체의 mass fragment 패턴
양파 유전자원에 함유된 flavonol 배당체의 경우, ESI source 를 장착한 single quadrupole MS에서 positive ionization mode 분석시, 제시된 그들의 mass spectra는 Fig. 2과 같다. 동정 된 flavonol 배당체는 aglycone인 quercetin와 isorhamnetin 에 하나 또는 두 개의 glucose (m/z 162) 결합된 형태를 나 타냈으며, 주로 H와 Na의 양이온이 결합된 형태로 검출되 었다. 주요 성분인 Q34'diG는 aglycone인 quercetin의 분자 량 m/z 303에 glucose 두 개가 결합되어 있는 구조를 갖고 있으며, 여기에 최종 Na 양이온이 붙어있는 형태(m/z 649)로 검출되었다. 특히 Q34'diG는 parent ion에서 한 개의 glucose 가 떨어져 나타난 fragment ion인 m/z 465를 갖고 있어 Chung et al. (2011)의 연구 결과와 일치하는 것을 확인할 수 있었 다. 또한 I4'G도 aglycone인 isorhamnetin (m/z 317)에 한 개 의 glucose 및 Na 양이온이 붙어있는 형태(m/z 501)로 검출 되었다.
양파 유전자원의 flavonol 배당체 함량 분포
고기능성 양파 품종 개발하기 위하여 75점의 양파 유전 자원 내 flavonol 배당체의 함량을 조사하였다. 모든 유전자 원의 flavonol 함량 범위는 0.18-6.47 mg/g이었으며, 2-4 mg/g 에 속하는 유전자원은 42점으로서 전체의 56%로 가장 높은 분포를 나타내었고, 4-6 mg/g의 19점(25%) 순으로 높게 나 타났다(Fig. 3). 이는 Perez-Gregorio et al. (2010)의 연구결 과와 비교할 때 비슷한 함량 범위를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
흰색 양파 유전자원의 총 flavonol 함량 범위는 0.18-6.47 mg/g (평균 3.23 mg/g)로 나타났으며, 자색 양파 유전자원의 총 flavonol 함량 범위는 2.39-6.47 mg/g (평균 4.41 mg/g) 로 흰색 양파보다 약 1.4배 높게 나타났다. 흰색 양파 유전 자원 내 flavonol 배당체 함량은 Q34'diG (평균 1.49 mg/g) > Q4'G (1.30) > I4'G (0.30) 순으로 나타났으며, 자색 양파 유전자원 내 flavonol 배당체 함량은 Q4'G (평균 1.89 mg/g) > Q34'diG (1.87) > I4'G (0.37) 순으로 나타났다. 특히 Q34'diG 및 Q4'G 함량은 자색 양파가 흰색 양파보다 각각 약 1.3배, 1.5배 높게 나타났다(Table 2). Caridi et al. (2007) 은 양파 6품종의 quercetin 배당체를 분석한 결과, 건조중량 기준 Q34'diG의 함량 범위는 1.53-4.04 mg/g, Q4'G의 함량 범위는 0.58-2.86 mg/g로 본 연구 결과와 비슷한 경향을 나 타내었다.
Table 2.
Flavonol composition and contents (mg/g DW) in white and purple onion accessions.
따라서 flavonol 배당체 중 Q34'diG 및 Q4'G 의 총 함량 비 율은 흰색 및 자색 양파 유전자원 모두 약 85% 이상으로 양파 의 주요 성분인 것을 확인할 수 있었다(Chung et al., 2011). Beesk et al. (2010)의 경우, 양파 중간부위에는 flavonol 배 당체 Q34'diG 및 Q4'G이 주요 성분으로서 함량도 거의 비 슷하고 안쪽부위는 Q34'diG이 주요 성분이라고 하는 반면, 바깥부위에서는 quercetin의 aglycone 형태가 주요 성분이 라고 보고하였다. 본 연구에서도 역시 flavonol 배당체 추출 시 껍질을 제외한 양파 전체를 사용하였기 때문에 모든 유 전자원에서 Q34'diG 및 Q4'G 함량이 높게 검출된 것으로 사료된다.
적 요
국내외 75점의 흰색 및 자색 양파 유전자원으로부터 총 5종의 flavonol 배당체(Q34'diG, Q3G, Q4'G, I4'G, Q)를 분 리 ․ 동정하였다. 양파 내 존재하는 flavonol 배당체는 aglycone 인 quercetin 및 isorhamnetin에 하나 또는 두 개의 glucose 가 결합된 형태로 검출되었다. 총 flavonol 함량 범위는 흰 색 양파가 0.18-6.47 mg/g, 자색 양파가 2.39-6.47 mg/g 이 었으며, 자색 양파가 평균 4.41 mg/g 로 흰색 양파(3.23 mg/g) 보다 약 1.4배 높았다. 양파의 주요 성분으로는 Q34'diG 및 Q4'G 총함량 비율이 흰색 및 자색 양파에서 모두 약 85% 이상을 보였다.
