콩(Glycine max L.)은 동아시아가 원산지로서 우리나라에 서는 중요한 식량작물의 하나로 재배되어 왔으며 필수 3대 영양소 중에서 가장 중요한 단백질이 40%로 우수한 단백질 공급원으로써 이용되어 왔다(Rahman et al., 2011). 또한 이 외에도 식이섬유, 티아민, 리보플라빈, 라이신, 폴리산, 비타 민, 철, 아연, 인, 칼슘 그리고 마그네슘 등 콩에는 기능성물 질들이 풍부하며 이에 따라 그 소비가 증가되고 있다(Kim et al., 2003; Lee et al., 2013; Lee et al., 2014). 하지만 재 배면적은 1990년에 152,265 ha에서 2007년에는 76,267 ha로 재배면적이 줄어들고 있으며 자급률도 1990년에는 20.1%에 서 2013년에는 9.7%로 감소하였다(STATISTICS KOREA) 따라서 콩의 자급률 증대를 위해 최근에 쌀 재고량이 증가 하면서 논에서의 콩 재배 면적이 증가하고 있는 추세이다. 논 콩 재배면적은 1990년에 6,575 ha에서 2014년에는 10,785 ha 로 증가하였다(STATISTICS KOREA). 이와 같이 재배환경 이 밭에서 논으로 바뀌었을 때 콩 종실에 미치는 영향에 대 한 많은 연구들이 수행되고 있다.
논과 밭의 경우 토양의 구성이 전혀 다르기 때문에 식물 체가 영양분을 흡수하는 능력, 근권의 형성에 미치는 영향, 그리고 토양의 구성 성분의 차이에 의한 식물체의 생장에 영향을 주며(Jung et al., 2012), 지하수면의 영향에 의하여 콩의 생리학적 특성과 수량에 영향을 준다(Shimada et al., 1995). 재배환경의 차이는 콩 종실의 화학적 구성에도 영향 을 주어 논과 밭에서 재배 시 유의하게 오일, 탄수화물, 마 그네슘, 그리고 칼슘 함량에서 차이를 보였다(Taira et al., 1977; Ishiguro et al., 2006). 또한, 재식밀도에 따라서도 종 자단백질과 인, 칼슘, 칼륨, 아연, 그리고 황과 같은 미네랄 함량이 2차 관계에서 차이를 보이며, 배수를 위한 고랑의 공간에 의해서도 콩의 생육과 생산량에 차이가 있다(Cho et al., 2006; Rahman et al., 2011). 논에서 재배된 콩의 경우, 밭에서 재배된 콩과 비교하여 백립중과 콩 종실의 크기가 유의하게 증가하였다는 보고도 있다(Kim et al., 2004). 이 처럼 재배환경의 변화요소에 의해 콩 종실에 포함된 요소들 이 변화하는 것을 알 수 있다.
논과 밭에서 재배된 공시품종에 대한 재배환경의 차이에 따른 단백질 발현양상을 비교분석하기 위하여 넓은 등전점 영역의 단백질을 높게 분리할 수 있는 능력을 가지고 있는 이차원전기영동 사용하였다(Cho et al., 2014). 전기영동을 통하여 얻은 단백질 발현양상의 차이를 수치화하기 위하여 이미지 분석을 실시하였다. 국내 육성 콩 품종들의 논에서 재배에 따라 생육반응과 수량성에 차이를 보였다(Kim and Cho 2005). 이처럼 같은 종의 식물 개체라고 하더라도 생육 과 수량에 차이를 보인다는 것은 생육단계와 조직기관에 따 라서 단백질의 발현 양상이 다를 수도 있다는 것을 의미한 다. 이것은 게놈 DNA의 염기서열이 동일 종 내에서는 같지 만 생육조건에 따라서 단백질의 발현은 다양한 변이를 나타 내기 때문이다(Woo et al., 2003). 따라서 본 연구에서는 논 과 밭의 재배적 환경에 따른 콩 종실 저장단백질 발현양상 의 차이를 비교함으로써 콩 종실 저장단백질의 발현양상에 대한 기초를 얻고자 수행하였다.
재료 및 방법
식물재료
재배 환경에 따른 단백질 발현을 비교분석하기 위하여 충 북대학교 부속농장 전작포장에 한남콩, 백천콩, 황금콩, 단 원콩을 파종하였으며, 시비는 콩 복비 50 kg/10a (N : P2O5 : K2O = 3 : 3 : 3.4 kg/10a)을 전량기비로 하였으며, 기타 재배관리는 콩 표준재배법에 준하였다. 종실을 재취하여 -20°C에서 보관하였다가 본 실험에 사용하였다.
단백질추출 및 정량분석
이차원전기영동을 위한 단백질 추출을 위하여 개화 후 시기 별로 채집된 시료의 지방을 제거하기 위하여 85%의 n-hexane을 사용하였다. 지방을 제거한 시료 0.1 g에 lysis buffer (4.8 g Urea, 0.2 ml NP-40, 0.2 ml Ampholyte pH 3.5-10, 0.5 ml 2-mercaptethanol, 0.5 g PVP-40/10 ml) 1 ml를 첨가하여 막대사발에서 혼합한 후 15,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 상등액을 취하고, 상등액을 분석하였다.
단백질 함량 분석은 Bradford (1976)의 방법에 595 nm에서 분광광도계(SHIMADZU, UV-1700)를 사용하여 측정하였다.
이차원전기영동 수행 및 이미지 분석
이차원전기영동(O'Farrell, 1975)은 넓은 등전점영역의 단 백질을 높게 분리할 수 있는 능력을 가지고 있는 일차원(등 전점) 전기영동 NA-1313 (Nihon-Eido)과 이차원 전기영동 은 NA-1130 (Nihon-Eido)을 사용였다. 일차원전기영동은 등전점전기영동으로 사용된 겔의 조성은 4.8 g Urea, 1.6 ml 30% Acrylamide solution, 2.84 ml DDW, 0.2 ml 10% NP-40, 0.25 ml Ampholyte pH 3.5-10, 0.25 ml Ampholyte pH 5-8, 15 μl 10% APS, 10 μl TEMED이다. 일차원 전기영동이 후 평형화가 끝난 겔을 이차원전기영동을 하였다. 이차원전 기영동은 12% separating gel (9.6 ml DDW, 17.7 ml 30.0% acrylamide solution, 16.4 ml 1.0M Tris-HCl (pH 8.8), 300 μl 10% Ammonium persulfate, 50 μl TEMED)과 5% Stacking gel (2.0 ml DDW, 1.0 ml 30.0% acrylamide solution, 3.0 ml 0.25M Tris-HCl (pH 6.8), 30 μl 10% Ammonium persulfate, 20 μl TEMED)을 사용하였으며 수행하였다. 전기영동이 끝난 후 겔은 은 염색법을 사용하였다. 은 염색의 경우에는 Amersham사의 PlusOne Silver Staining Kit, Protein을 사 용하여 염색을 하였다. 이차원전기영동의 결과는 컴퓨터 프 로그램(Image analysis; nonlinear사의 Progenesis Worstation)을 사용하여 겔상에서 단백질 spot의 변화를 비교분석하였다.
결과 및 고찰
이차원전기영동을 이용한 재배환경 차이에 따른 단백질 발 현 양상 비교 분석
논과 밭에서 콩을 재배하였을 경우, 재배환경의 변화에 따른 단백질 발현 양상을 비교함으로써 논 콩 재배시 단백 질의 변화에 대한 기초자료를 얻고자 본 연구를 수행하였 다. 각 재배환경에 4개의 육성품종을 공시하였다. 공시된 품종들로부터 성숙된 종실을 얻어 이차원전기영동을 통하 여 1차적으로 단백질 발현 양상을 비교하고 2차적으로 이 미지분석을 통하여 단백질 발현 양상을 수치화하여 각각의 단백질 spot의 발현 정도를 비교하였다. 이차원전기영동 결 과를 보면, 재배환경의 차이에 따른 단백질 발현양상은 공 시품종들 모두 큰 차이를 보이지 않았으며 전반적으로 논과 밭에서의 단백질 발현양상은 매우 유사하였다. 하지만 소수 의 특정부분에서 단백질 발현정도의 차이를 보였으며 또한 비록 많은 수의 단백질 spot은 아니지만 논과 밭의 재배 환 경의 차이에 따라 발현이 되지 않는 단백질도 확인하였다. 각 공시품종의 이차원전기영동결과를 재배환경의 차이에 따 라 비교해 보면, 한남콩의 경우에는 전반적으로 저분자에서 고분자와 산성에서 염기성에 이르는 단백질의 발현양상이 재배환경의 차이와 상관없이 유사한 단백질 발현양상을 보 였다. 하지만, 전반적으로 유사한 단백질 발현 양상을 보였 으나, 30.0 kDa부분의 염기성부근의 단백질 발현정도의 차 이를 보였다. 또한 이러한 양상은 20.1 kDa부분의 중성부분 에서도 같은 현상을 보였다. 밭에서 재배된 한남콩이 위에 서 언급한 두 부분에서 단백질 발현 정도가 논에서 재배된 한남콩에 비하여 높았던 반면에 20.1 kDa부분의 염기성부 분에서 밭에서 재배된 한남콩에서는 발현되지 않은 단백질 이 논에서 재배된 한남콩에서 발현되는 것을 확인하였다 (Fig. 1).
백천콩의 단백질 발현 양상을 비교한 결과를 보면, 한남 콩과는 반대의 경향으로 밭에서 재배환 백천콩의 단백질 발 현 정도가 논에서 재배된 발현 정도보다 높은 것을 알 수 있었다. 특히, 20.1-45.0 kDa 부분의 중성부위에서 단백질 발현 정도가 뚜렷한 차이를 보였다. 백천콩의 경우도 재배 환경의 변화는 단백질의 발현 양상에는 큰 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다(Fig. 2).
Fig. 2.
Comparison of protein spots between Paddy field and Upland field on Beakcheonkong using 2-DE.황금콩은 45.0 kDa 부분의 산성부분에서 단백질 발현 정 도가 논에 비하여 밭에서 높았으며 반대로 30.0 kDa 부분 의 산성부분에서는 밭에서 보다 논에서 높은 단백질 발현 정도를 보였다. 저분자인 20.1 kDa 부분의 염기성부분에서 는 단백질 발현 정도가 논에 비하여 밭에서 약간 높은 것을 확인할 수 있었다. 황금콩의 경우도 한남콩과 마찬가지로 재배환경에 따라 발현 되지 않은 단백질을 20.1 kDa의 저 분자부분의 염기성부분에서 확인할 수 있었다(Fig. 3).
Fig. 3.
Comparison of protein spots between Paddy field and Upland field on Hwangkeumkong using 2-DE.단원콩은 공시품종들중에 가장 재배환경에 영향을 받지 않는 것으로 단백질 발현양상의 확인을 통하여 알 수 있었 다. 공시품종들의 논과 밭에서 재배환경의 차이에 따른 단 백질 발현 양상은 이차원전기영동의 결과만으로는 정확한 단백질 발현 정도의 차이를 확인할 수 없었다. 따라서 이차 원전기영동을 통하여 확인된 단백질 발현 양상을 이미지 분 석 프로그램을 이용하여 수치화함으로써 재배환경의 차이 에 따른 공시품종들의 단백질 발현 정도를 비교분석하였다.Fig .4
이미지분석을 이용한 재배환경 차이에 따른 단백질 발현 정도 비교 분석
이미지 분석을 통해 수치화한 결과를 각 공시품종별로 비 교하여 보면, 한남콩의 경우에는 단백질 spot들을 무작위로 40 개를 선택하여 단백질 발현 정도를 수치화한 protein normal volume을 비교분석하였다(Fig. 5, Table 1).
Table 1.
Comparison on degree of protein expression in Hannamkong between upland field and paddy field by using image analysis (Each spot number in Fig. 5).
논과 밭에서 재배된 한남콩의 단백질 발현 정도를 보면 (Table 1), 총 40개의 단백질 spot들 중 밭에 비하여 논에서 13개의 단백질 spot들의 protein normal volume이 증가하였 으며, 27개의 단백질 spot들의 protein normal volume이 감 소하였다. 이러한 현상은 논에서 한남콩을 재배하였을 경우 전반적으로 단백질의 발현이 감소한다는 것을 의미한다. 단 백질 spot 1번과 26번은 다른 단백질 spot들에 비하여 논에 서 2배 이상 protein normal volume이 감소하였다. 평균적 으로 밭에서 재배된 한남콩의 단백질 발현 정도는 논에서보 다 protein normal volume이 약 1.31배 감소하였으며 약 1.14배 증가하였다. 전체적으로는 논에서 재배된 한남콩의 protein normal volume이 밭에서 재배된 한남콩의 protein normal volume보다 약 0.15배 감소하였다.
백천콩에서도 역시 40개의 단백질 spot들을 선발하여 protein normal volume을 비교분석하였다(Fig. 6, Table 2). 단백질 spot 26번은 발현 정도가 논에서 재배된 백천콩의 protein normal volume이 밭에서 재배된 한남콩의 protein normal volume 보다 약 1.8배 이상 감소하였으며, 이와는 반대로 단백질 spot 9번의 protein normal volume은 약1.8배 이상 증가하였다(Table 2). 40개의 단백질 spots 분석 결과, 밭에 비하여 논에서 23개의 단백질 spot들의 normal volume은 증가하였고 16개의 단백질 spot들의 normal volume은 감소 하였으며 1개의 단백질 spot들의 normal volume은 변화가 없었다. 평균적으로 밭에서 재배된 백천콩의 단백질 발현 정도는 논에서보다 protein normal volume이 약 1.17배 감 소하였으며 약 1.19배 증가하였다. 전체적으로는 논에서 재 배된 한남콩의 protein normal volume이 밭에서 재배된 한 남콩의 protein normal volume보다 약 0.31배 증가하였다.
Table 2.
Comparison on degree of protein expression in Baekcheonkong between upland field and paddy field by using image analysis (Each spot number in Fig. 6).
황금콩과 단원콩의 경우에는 단백질 발현 양상이 한남콩 과 백천콩에 비하여 다소 단백질 spot들이 감소되는 양상을 보였다. 따라서 황금콩과 단원콩의 경우에는 무작위로 단백 질 spot 30개를 선발하여 protein normal volume을 비교분 석하였다(Fig. 7, Table 3).
Table 3.
Comparison on degree of protein expression in Hwangkeumkong between upland field and paddy field by using image analysis (Each spot number in Fig. 7).
단백질 spot 15번은 논에서 재배된 황금콩의 protein normal volume이 밭에서 재배된 황금콩의 protein normal volume 에 비하여 발현 정도가 약 1.6배 이상 감소하였으며 단백질 spot 14번의 protein normal volume은 약1.3배 이상 증가하 였다(Table 3). 황금콩은 논에서 재배할 경우, 단백질 spot 들의 protein normal volume이 전반적으로 감소하는 경향 을 보였다. 30개의 단백질 spot들 중밭에 비하여 논에서 11 개의 단백질 spots의 normal volume은 증가하였고 19개는 감소하였다(Table 3). 평균적으로 밭에서 재배된 황금콩의 단백질 발현 정도는 논에서보다 protein normal volume이 약 1.16배 감소하였으며 약 1.19배 증가하였다. 전체적으로 는 논에서 재배된 한남콩의 protein normal volume이 밭에 서 재배된 한남콩의 protein normal volume보다 약 0.30배 감소하였다.
단원콩의 경우는 논에서 밭에서 재배된 단원콩의 단백질 spot 20번의 protein normal volume이 약 1.3배 이상 감소 하였으며 단백질 spot 28번의 protein normal volume은 약 1.4배 이상 증가하였다(Table 4). 30개의 단백질 spot들의 분 석 결과, 밭에 비하여 논에서 16개의 단백질 spot들의 protein normal volume은 증가하였고 14개는 감소하였다. 단원콩은 논 재배시 30개의 분석 결과 감소와 증가의 변화 비율이 거 의 동일한 경향을 보였다(Table 4). 평균적으로 밭에서 재배 된 단원콩의 단백질 발현 정도는 논에서보다 protein normal volume이 약 1.16배 감소하였으며 약 1.13배 증가하였다. 전체적으로는 논에서 재배된 한남콩의 protein normal volume 이 밭에서 재배된 한남콩의 protein normal volume보다 약 0.06배 증가하였다.
Table 4.
Comparison on degree of protein expression in Danwonkong between upland field and paddy field by using image analysis (Each spot number in Fig. 8).
결과적으로, 한남콩과 황금콩은 논에서보다 밭에서 재배 했을 경우 단백질의 발현 정도가 높았으며, 이와는 반대로 백천콩은 논에서 재배하였을 경우 단백질 발현 정도가 높은 것으로 확인되었다. 단원콩은 논에서 재배하였을 경우 단백 질 발현 정도가 약간 높은 것으로 확인되었으나 그 증가가 약 0.06로 거의 재배환경의 차이에 따른 단백질 발현 정도 는 거의 차이가 없는 것으로 확인되었다.Fig .8
재배환경의 차이는 콩 종실의 화학적 구성 및 크기와 수 량성에서도 차이가 있다고 보고되었다(Taira et al., 1977; Kim et al., 2004; Cho et al., 2006; Rahman et al., 2011). 이처럼 재배환경의 변화요소에 의해 콩 종실에 포함된 요소 들이 변화하는 것을 알 수 있다. 이와 같이 본 연구의 결과 를 보면, 재배환경의 변화가 주요 단백질 발현 양상에는 영 향을 주지는 않았으나 단백질 발현 정도의 차이에는 영향을 주는 것을 알 수 있었으며 품종에 따라 재배환경의 변화에 의한 단백질 발현 정도에 차이가 있음을 알 수 있었다.
본 연구는 재배환경의 변화, 즉 밭 작물인 콩이 토양의 구 성이 다른 논에서 재배되었을 경우, 단백질 발현 양상과 정 도에 어떤 영향을 주는지 기초자료를 얻고자 수행하였다. 향후, 재배환경에 따른 단백질 총량을 비교하고, 질량분석 을 통하여 재배환경에 따라 증가 또는 감소되는 단백질들이 어떤 기능을 가진 단백질인지 확인 할 필요가 있다고 사료 된다.
적 요
재배환경에 따른 단백질 발현을 이차원전기영동을 이용 하여 단백질 발현양상을 확인하고 이미지 분석을 통하여 단 백질 발현 정도를 수치화하여 비교 분석한 결과, 재배환경 에 따른 단백질 발현 양상은 전반적으로 매우 유사하였으 며, 주요 단백질의 발현에는 차이가 없었다. 하지만 논과 밭, 즉 재배환경은 단백질의 발현 정도에는 영향을 미치는 것을 확인 할 수 있었다. 공시품종들 중에서 백천콩은 다른 세 품종과는 다르게 논에서 단백질 발현 정도가 밭에서의 단백질 발현 정도보다 높았다. 이 결과로 보아 품종마다 재 배환경에 따른 단백질의 발현 정도에 차이가 있는 것으로 사료된다. 향후, 단백질 총 함량을 재배환경에 따라 비교하 고 또한 질량분석을 통하여 증가 또는 감소되는 단백질의 기능을 확일 할 필요가 있다고 사료된다.
