수수(Sorghum bicolor L. Moench)는 아프리카와 아시아의 반건조 지역에서 주식으로 이용되는 식량작물로서 전세계 적으로 주식보다는 동물 사료로 많이 이용된다. 하지만 수 수는 에너지 공급원으로서 탄수화물, 단백질, 무기성분, 비 타민 등의 영양학적 측면이 우수하고 건조한 기후에서 다른 식량 작물들보다 안정적인 생육이 가능하여 미래의 주요 식 량으로 이용할 수 있는 가치가 높다(Wang et al., 2011; Yaylor et al., 2006). 또한 미래 에너지인 바이오 에탄올을 만드는 재료로 사용할 수 있고 바이오 플라스틱의 재료로서도 가능 성이 있어 매우 유용한 작물이다(Wang et al., 2008). 이때 까지 수수 grain에 함유된 폴리페놀 화합물은 항산화, 항비 만, 항당뇨, 항염증 활성과 혈액응고저해 및 혈전용해 효과 등의 건강에 유용한 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Awika & Rooney, 2004; Chung et al., 2011; Kim et al., 2013; Park et al., 2012). 하지만 수수를 도정할 때 발생되는 부산물인 수수 hull과 bran에 대해서는 대표적인 항산화성 분인 폴리페놀계 화합물, 항산화 활성 등의 기본적인 연구 와 식용 색소로 사용하기 위한 기본적인 독성 연구는 수행 되었으나(Olifson et al., 1978; Woo et al., 2010) 수수 부산 물이 함유하는 천연색소 함량에 대한 정보나 항산화 활성 외의 다른 활성에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
염증반응이란 체내에 바이러스나 박테리아, 오염물질 등의 외부물질이 들어오거나 비정상적인 세포 분열 등의 발생을 방 어하기 위한 반응이다. 이때 기관지 상피세포나 평활근세포 등 의 각종 방어 세포에서는 염증반응을 일으키는 매개체인 히스 타민이나 ROS, nitiric oxide (NO), TNF-α, proinflammatory cytokine, prostaglandin (PG)등의 물질을 분비한다(Barnes et al., 1998; Kim et al., 2012). 이러한 물질 중 NO는 PG와 함께 염증 반응을 일으키는 중요 인자로 박테리아, 기생충, 암 발생 등이 원인으로 발생하는 것으로 알려져 있었으나 이러한 원인 외에도 대식세포의 비정상적인 활성으로 인해 NO 발생이 촉진되어 류머티즘성 관절염이나 패혈증쇼크 등 의 염증반응으로 인한 각종 질병을 유발할 수 있음이 알려졌 다(Chung et al., 2007). 따라서 염증반응으로 인한 질병 치 료에 비정상적인 대식세포 활동을 조절하는 것이 주요한 치 료 방법으로 여겨지고 있다. 이에 본 연구에서는 수수 grain 과 도정시 발생하는 도정부산물의 용매별 추출물의 항산화 활성과 함께 대표적인 천연색소 함량과 염증 세포를 이용한 항염증 활성을 평가하였다.
재료 및 방법
시료 및 추출물 제조
본 연구에 사용된 수수는 2013년 국립식량과학원 기능성 작물부 시험포장에서 생산된 황금찰수수를 탈곡하여 도정 했을 때 얻어지는 부산물로서 hull과 bran을 grain과 분리하 여 따로 모아 100메쉬로 분쇄하여 -20°C에서 보관하면서 시 료로 사용하였다. 추출물은 시료 1 g을 칭량하여 각각 100% 메탄올, 0.5% (v/v) HCl을 함유한 100% 메탄올, 100% 에 탄올, 70% 에탄올 용액 20 mL으로 10분간 초음파 추출 후 24시간 교반 추출한 다음 감압농축하여 제조하였다.
총 폴리페놀 함량 분석
수수 grain과 도정부산물 추출물의 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Ciocalteau colorimetric method (Seo et al., 2011)를 사용하여 분석하였다. 100메쉬로 분쇄한 시료 1g을 100% 메탄올, 0.5% (v/v) HCl을 함유한 100% 메탄올, 100% 에 탄올, 70% 에탄올 용액 20 mL로 37°C에서 24시간 동안 교 반 추출하여 추출물 0.1 mL와 0.2 mL의 Folin-Ciocalteau’s phenol (Sigma, St. Louis, MO, USA)용액과 혼합한 후, 3 mL의 5% Na2CO3 용액과 혼합하였다. 이 혼합용액은 30°C 에서 2시간 동안 반응시킨 후, spectrophotometer (Versa max, Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 765 nm에서의 흡광도를 측정하였고 총 폴리페놀 함량은 galic acid (mg CGA/100 g extract)의 함량과 비교하여 계산하였다.
천연색소 함량 측정
천연색소는 표품으로서 apigenin, apigeninidin, luteolin, luteolinidin (Extrasynthese, Genay, France)을 0.5% HCl을 함유한 메탄올로 희석하여 검량선을 작성하였다. 수수 grain 과 도정부산물 추출물의 색소는 Ultra-hiperformance liquid chromatography (UPLC, ACQUITY, Waters, Milford, MA, USA)로 분석하였다. 시료는 100메쉬로 분쇄한 뒤 1 g을 20 mL의 100% 메탄올, 0.5% (v/v) HCl을 함유한 100% 메탄 올, 100% 에탄올, 70% 에탄올의 용매로 30°C에서 24시간 동안 교반 추출하였다. 추출물은 3,000 rpm에서 10분간 원 심분리하여 상등액을 취해 0.2 μm 필터(Advantec MFS Inc., Dublin, CA, USA)로 여과하여 UPLC로 분석하였다. UPLC 분석에 사용된 컬럼은 Waters ACQUITY BEH C18 (particle size 1.7 μm, 2.1 x 100 mm)을 30°C로 유지하여 사용하였 고, 이동상은 0.1% trifluoroacetic acid (TFA, Sigma)를 함유 한 초순수 증류수(A)와 아세포나이트릴(Merck, Darmstadt, Germany) (B)를 사용하였다. 이동상 용액 A에 대한 용액 B 의 비율은 초기 용매 조건 3%, 10분에 20%, 13분에 30%, 15분에 50%, 16분에 90%까지 점차 혼합하였고 20분에는 3%를 유지하여 1분간 초기 용매 조건 상태를 유지하였다. 이동상의 유속은 0.4 mL/min, PDA 검출 파장은 254 nm이 었다.
ABTS 라디칼 소거능 측정
ABTS (2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate), Sigma) 라디칼 소거능 측정은 Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) 분석법을 변형하여 수행하였다(Khan et al., 2012). ABTS 용액은 7 mM ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.4 mM이 되도록 용해시킨 다음 암실에서 4~8시간 동안 반응시켜 흡광도 값을 안정시킨 후 사용하였다. ABTS 용 액 0.9 mL에 일정 농도의 시료액 0.1 mL을 가하여 잘 혼합 한 다음 실온에서 1분간 반응시켜 734 nm에서 흡광도를 측 정하였으며, ABTS 라디칼 소거능은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도(A) 비(%)로 나타내었다.
ABTS radical scavenging activity (%) = [(Ablank − Asample)/Ablank] × 100
세포 배양
RAW 264.7 세포주는 한국세포주은행에서 분양받아 사 용하였다. 10% FBS와 1% penicilin-streptomycin을 포함하 는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 의 조건에서 배양하였다.
세포 독성 측정
수수 grain과 도정부산물 추출물의 세포에 대한 독성은 배양 세포에 각 추출물을 처리한 후, 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma) 측정 으로 분석하였다(Moro et al., 2012). 96 well plate에 5,000 cells/well 으로 세포를 분주 한 뒤, 수수 도정부산물 추출물 을 농도별로 48시간 처리하였다. 처리 후 MTT 용액(0.5 mg/mL)을 처리하여 2시간 배양 후 microplate reader (Versa max, Molecular Devices Co.)를 이용하여 550 nm에서 흡 광도를 측정하였고, 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.
Nitric Oxide 생성량 측정
생성되는 Nitric Oxide (NO) 농도는 Griess Reagent System (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 측정하였다(Yang et al., 2009). 96 well plate에 RAW 264.7 세포를 5,000 cells/well으로 분주 한 뒤, 12시간 배양 후 농도별 수수 grain 및 도정부산물 추출물과 1 μg/mL 농도의 lipopolysaccharide (LPS, Sgima)을 처리하여 48시간 배양하였다. 배양액의 상 등액을 Griess Reagent System으로 반응시킨 후 548 nm에 서 흡광도를 측정하여 NO 함량을 정량하였다.
결과 및 고찰
조추출물 함량
수수를 탈곡 및 도정하였을 때 grain과 함께 발생하는 hull, bran의 용매별 추출률을 Table 1에 나타내었다. Hull과 grain 에서는 0.5% 염산을 함유한 100% 메탄올 용액에서 각각 15.0%, 14.1%의 추출률로 가장 높은 추출 효율을 보였고, 100% 에탄올에서 추출 효율이 각각 4.4%, 5.6%으로 가장 낮게 추출된 반면, bran에서는 100% 에탄올 추출 시 30.9% 로 가장 높게 나타났다.
Table 1.
Crude extracts contents according to different solvents from milling by-product and grain of sorghum.
| Solvents | Milling by-product (%)1) | Grain (%) | |
|---|---|---|---|
| Hull | Bran | ||
| MeOH | 4.9±0.4 | 18.7±1.7 | 6.0±1.3 |
| MeOH (0.5%(v/v)HCl) | 15.0±0.9 | 14.2±2.1 | 14.1±1.9 |
| EtOH | 4.4±0.7 | 30.9±2.5 | 5.6±1.3 |
| 70% EtOH | 6.9±0.1 | 15.1±0.9 | 6.6±0.4 |
수수 도정부산물의 폴리페놀 함량과 항산화 효과
추출한 용매에 따른 수수 grain과 도정부산물의 항산화 성분으로서 총폴리페놀 함량과 천연물의 항산화 활성을 평 가하는 기본적인 방법으로서 ABTS 라디컬 소거능을 측정 하였으며(Tirzitis & Bartosz, 2010) 그 결과를 Table 2에 나 타내었다. 도정부산물인 hull, bran과 grain의 용매에 따른 폴리페놀 함량을 분석한 결과, 4가지 추출 용매 모두에서 hull 추출물의 경우 26.8~29.7 mg/100 g으로 가장 많았고 bran과 grain의 총 폴리페놀 함량은 15 mg/100 g 내외로 비 슷한 수준이었다. 추출용매별로 hull에서는 100% 메탄올, 70% 에탄올 추출에서 각각 29.4±0.4, 29.7±0.2 mg/100 g, bran은 에탄올 추출에서 17.4±1.0 mg/100 g, grain에서는 70% 에탄올 추출에서 14.5±0.0 mg/100 g 총 폴리페놀이 가장 많이 추출되었다. 이 결과는 Woo et al. (2010)이 황금 찰수수 도정시 발생하는 bran의 메탄올 추출물이 가장 높은 총 폴리페놀 함량을 나타내고, 그 다음으로 hull 추출물이 많았고 grain의 폴리페놀 함량이 가장 적음을 보고한 것과 비슷한 경향을 나타내었다. 다만 본 연구에서는 hull이 bran 보다 1.5~3.0배 더 많은 총 폴리페놀 함량을 나타내었다. ABTS 라디컬 소거능을 이용한 항산화 활성은 각 추출물에 의해 ABTS 라디컬이 50%가 소거되는 농도인 IC50 값으로 나타내었다(Table 2). ABTS 라디컬 소거능에서는 총 폴리 페놀 함량과 같은 경향으로 hull의 100% 메탄올 추출물과 70% 에탄올 추출물에서 각각 IC50 값이 6.8±0.4, 6.3±0.1 μ g/mL 으로 가장 활성이 높았고, bran과 grain에서는 이보다 낮은 19.9~29.6 μg/mL 으로 비슷한 수준이었다. 이 결과 역 시 폴리페놀 함량이 높은 추출물이 항산화 활성이 높다고 보고한 Woo et al. (2010) 결과와 같은 경향을 나타내었다.
Table 2.
Contents of total polyphenol and ABTS radical scavenging activity of grain and milling by-product of sorghum.
| Total polyphenol (mg GAE/100 g)1) | ABTS radical scavenging activity (IC50, μg/mL)1),2) | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Solvents | Hull | Bran | Grain | Hull | Bran | Grain |
| MeOH3) | 29.4±0.4a | 10.2±0.4c | 12.9±0.4b | 6.8±0.4a | 19.9±0.0b | 29.6±1.8c |
| MeOH (0.5%(v/v)HCl)3) | 26.8±0.0a | 16.0±0.9b | 13.4±0.0c | 10.4±1.0a | 26.2±0.0c | 23.2±0.5b |
| EtOH3) | 27.2±0.1a | 17.4±1.0b | 11.8±0.1c | 9.2±0.4a | 27.0±0.8b | 27.7±6.2b |
| 70% EtOH3) | 29.7±0.2a | 13.5±0.4b | 14.5±0.0c | 6.3±0.1a | 25.4±0.4b | 23.0±0.7c |
2)Concentration at which 50% inhibition is achieved.
3)Means are significantly different (ρ<0.05) by Duncan s multiple range test. Mean values in same line with different letter of total polyphenol and ABTS radical scavenging activity, respectively, are significantly different.
추출 용매에 따른 수수 grain과 도정부산물의 천연색소 함량
유색 수수 식물체에서 발견되는 플라보노이드 중 3-deox yanthocyanidin 계열 화합물로서 apigeninidin과 luteolinidin 이 가장 많이 보고되어 있고, 다른 플라보노이드로서 apigenin, luteolin, naringenin 등이 보고되어 있다(Awika et al., 2004; Dykes et al., 2009; Kouda-Bonafos et al., 1994). 수수 grain과 도정부산물을 4가지 추출용매를 사용하여 추출하였을 때, 대표적인 수수 함유 천연색소인 luteolinidin, apigeninidin, luteolin, apigenin의 함량을 UPLC를 이용하여 분석한 결과, Table 3와 같이 총 천연색소 함량은 수수 hull의 0.5% 염산 함유 100% 메탄올 추출물에서 322.6±14.5 mg/100 g으로 가장 많은 색소 함량을 나타내었고, 100% 메탄올 추출물에 서 283.2±7.0 mg/100 g, 에탄올 추출물에서 266.9±5.5 mg/100 g, 70% 에탄올 추출물에서 243.3±3.9 mg/100 g으로 네 가지 추출 용매 모두에서 수수 hull의 색소 추출률이 가장 높았 다. 또한 수수 hull, bran, grain 모두의 경우에서 0.5% 염산 을 함유한 100% 메탄올을 용매로 추출한 경우, 나머지 세 가지 추출 용매보다 네 가지 색소에서 모두 높은 함량을 보 였다. 이 결과는 수수를 이용하여 천연색소를 추출할 경우 산을 함유한 메탄올로 추출하였을 때 다른 용매보다 다량의 색소 추출물을 얻을 수 있음을 시사하였으며, grain보다 수 수 부산물인 hull에서 더 많은 색소 추출물을 얻을 수 있음 을 나타내었다. 따라서 색소 추출량이 많은 0.5% 염산을 함 유한 100% 메탄올 추출물을 RAW 264.7 대식세포에 처리 하여 세포독성과 염증인자인 NO 생성량을 측정하였다.
Table 3.
Major natural pigments content according to the extraction solvents in milling by-product and grain of sorghum.
| Natural pigment contents (mg/100 g of dry weight)1) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Extraction solvent | Luteolinidin | Apigeninidin | Luteolin | Apigenin | Total2) | |
| Hull | MeOH | 16.1±0.3 | 42.7±0.8 | 20.2±0.1 | 204.2±7.4 | 283.2±7.0b |
| MeOH (0.5%(v/v)HCl) | 32.5±1.5 | 88.1±2.3 | 32.0±3.3 | 176.6±3.5 | 322.6±14.5a | |
| EtOH | 11.8±0.1 | 43.3±0.5 | 18.5±0.7 | 193.4±4.5 | 266.9±5.5b | |
| 70% EtOH | 8.6±0.2 | 18.6±0.2 | 22.9±1.1 | 193.2±3.0 | 243.3±3.9c | |
| Bran | MeOH | 10.9±0.7 | 31.9±0.7 | 5.7±0.2 | 8.4±2.2 | 56.9±3.1b |
| MeOH (0.5%(v/v)HCl) | 11.6±1.6 | 80.0±5.5 | 9.4±0.2 | 20.5±2.3 | 121.5±9.3a | |
| EtOH | 4.6±0.4 | 31.6±0.5 | 3.1±0.1 | 4.6±0.6 | 44.0±0.2c | |
| 70% EtOH | 12.0±0.4 | 13.9±1.2 | 6.8±0.2 | 12.7±0.6 | 45.3±2.7c | |
| Grain | MeOH | 2.5±0.3 | 57.3±1.3 | 1.1±0.2 | 1.8±0.3 | 63.0±1.2b |
| MeOH (0.5%(v/v)HCl) | 1.2±0.1 | 123.7±1.6 | 2.5±0.1 | 4.1±0.2 | 131.5±1.6a | |
| EtOH | 1.7±0.2 | 26.5±4.0 | 1.1±0.4 | 2.2±0.8 | 31.6±3.7c | |
| 70% EtOH | 1.1±0.1 | 19.7±0.8 | 1.2±0.2 | 1.9±0.4 | 23.9±1.0d | |
세포 독성
도정부산물과 grain의 천연색소 함량이 가장 높았던 0.5% 염산을 함유한 100% 메탄올 추출물과 apigeninidin을 비롯 한 주요 천연색소의 세포에 대한 독성은 MTT assay법을 이 용하여 RAW 264.7 대식세포에서 확인하였다(Fig. 1). 추출 물을 농도별(50, 100, 200, 400, 500 μg/mL)로 처리하였을 때 hull과 grain에서는 500 μg/mL에서도 세포 독성이 나타 나지 않았으나, bran 추출물은 200 μg/mL 이하의 농도에서 90% 이상의 생존율을 보이는 것으로 나타났다. 천연색소 화합물의 경우, 농도별(10, 20, 40, 80 μM)로 처리하였을 때, luteolinidin과 apigeninidin은 80 μM까지 세포 독성이 나타나지 않았으나, apigenin은 20 μM 이하의 농도에서 90% 이상의 생존율을 보이는 것으로 나타났고, luteolin은 10 μM 이하의 농도에서 세포독성이 나타나지 않음을 확인 하였다.
Fig. 1.
Effects of sorghum milling by-product methanol-extract (containing 0.5% HCl) (A) and four pigments on cytotoxicity (B) in RAW 264.7 cells. Each of samples was treated with different concentrations in RAW 264.7 cells for 48 hr. Results are expressed as mean±SD (n=3) and means are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test. Mean values in same column with different letter are significantly different. C1: luteolinidin, C2: apigeninidin, C3: luteolin, C4: apigenin.Nitric Oxide 생성량 측정
세포 독성과 마찬가지로 수수 hull, bran과 grain 추출물 의 LPS로 NO 생성을 유도한 RAW 264.7 세포에서의 NO 함량을 측정하였다. Fig. 2에서와 같이 처리 농도 50 ug/mL 에서는 bran 추출물의 NO 함량이 가장 낮았으나 추출물 처 리 간 유의한 차이는 보이지 않았고, 세 추출물 모두 세포 독성이 나타나지 않은 100 ug/mL 이하에서의 NO 생성 억 제량은 hull, bran, grain의 순으로 나타났다. 세 추출물에서 모두 농도 의존적으로 NO 생성 함량이 줄었으며, hull 추출 물의 경우가 농도에 따라 가장 큰 NO 생성 억제를 보이는 것으로 나타났다(Fig. 2A) 세포 독성 결과와 비교해 볼 때, 200 μg/mL 이상의 농도에서 NO 생성량이 줄어드는 bran 추출물의 경우는 그 이상의 농도에서 보이는 세포 독성의 영향으로 생각되며, hull과 grain 추출물은 세포 독성이 없 는 500 μg/mL 까지 NO 생성량이 유의적으로 감소한 것으 로 확인하였다. 천연색소 화합물의 경우에서도 마찬가지로 luteolinidin을 제외한 나머지 화합물은 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하는 것으로 나타났으나, apigenin 40 μM 과 luteolin 20 μM 이상의 농도로 RAW 264.7 세포에 처리 했을 때 나타나는 NO 생성 감소율은 세포 독성에 의해 영 향을 받은 결과로 해석되며, apigeninidin을 농도별로 처리 하였을 때 NO 생성량이 유의하게 감소하였고 luteolinidin 은 NO 생성 감소 효과가 없었다.
Fig. 2.
Effects of sorghum milling by-product methanol-extract (containing 0.5% HCl) (A) and four pigments on NO production (B) in LPS-induced RAW 264.7 cells. Each of samples was treated with different concentrations in RAW 264.7 cells. Results are expressed as mean±SD (n=3) and means are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test. Mean values in same column with different letter are significantly different. C1: luteolinidin, C2: apigeninidin, C3: luteolin, C4: apigenin.적 요
유색 수수인 황금찰수수를 도정할 때 grain과 함께 발생 하는 도정부산물인 hull과 bran의 4가지 용매 추출물의 총 폴리페놀 함량, 항산화 활성, 천연색소 함량과 RAW 264.7 세포주를 이용하여 항염증 활성을 검정하였으며 결과를 요 약하면 아래와 같다.
도정부산물인 hull의 100% 메탄올과 70% 에탄올 추 출물에서 총 폴리페놀 함량이 29.4±0.4와 29.7±0.2 mg GAE/100 g으로 가장 많았고, ABTS 라디컬 소거능(IC50) 이 6.8±0.4, 6.3±0.1 μg/mL로 가장 높은 항산화 활성 을 나타내었다.
총 천연색소 함량에서도 수수 hull의 0.5% 염산 함유 100% 메탄올 추출물에서 322.6±14.5 mg/100g으로 가 장 많은 색소 함량을 나타내었고 hull, bran, grain 모 두의 경우에서 0.5% 염산을 함유한 100% 메탄올을 용매로 추출한 경우에서 가장 많아 수수를 이용하여 천연색소를 추출할 경우 수수 부산물인 hull을 산을 함 유한 메탄올로 추출하였을 때 가장 많은 색소 추출물 을 얻을 수 있었다.
수수 도정부산물과 grain 추출물을 LPS로 NO 생성을 유도한 RAW 264.7 세포에 처리하였을 때, 세포 독성 이 없는 100 ug/mL 농도 이하에서의 NO 생성 억제량 은 hull, bran, grain 추출물의 순으로 나타났고 hull 추 출물의 경우에 농도에 따라 가장 큰 NO 생성 억제를 보였으며 천연색소 화합물 중에서는 apigeninidin의 NO 생성 억제 활성을 확인하였다.
위 결과를 종합해 볼 때, 수수 도정부산물 중 hull은 grain 에 비해 총 폴리페놀 화합물과 천연색소 함량이 높고 항산화 활성과 RAW 264.7 대식세포에서의 NO 생성 량 억제 활성이 우수하여 앞으로 수수 부산물이 항산 화 및 항염증 소재로 가능성이 있음을 확인하였다.s
