콩(Glycine max (L.) Merr.) 종자에는 대체적으로 수용성 탄수화물 11%, 단백질 40%, 지방 21% 정도의 3대 영양소 가 골고루 함유되어져 있어 예로부터 양질의 단백질과 지질 의 공급원으로 널리 이용되어져 왔다(Openshaw and Hadley, 1978). 콩 성숙 종자의 탄수화물은 50%의 insoluble carbohydrate 와 50%의 soluble carbohydrate로 이루어져 있다. Insoluble carbohydrate에는 pectin, celluose, hemicellulose, starch등 이 있고 soluble carbohydrate에는 mono- saccharide (glucose, fructose), di-saccharide (sucrose), raffinose oligosaccharide (raffinose, stachyose)가 있으며, 주요 soluble sugar는 sucrose, raffinose, stachyose로 구성되어져 있다. Raffinose 및 stachyose 는 콩류에 가장 많이 함유되어 있는 올리고당으로 대두 올 리고당이라고도 불린다. 올리고당은 단당이 2-10개 정도 결 합한 oligomer로 분자량 300-2,000가량의 저분자 물질로 인 체 효소에 의해 분해․흡수되지 않는 난소화성이다. 올리고당은 식물계에 널리 분포되어 있으나 sucrose가 약 5%, raffinose 가 1%, stachyose가 4% 정도로 콩에 특히 많이 존재한다. Raffinose와 stachyose는 sucrose에 galactose가 α-1, 6결합 으로 1개 또는 2개 결합되어 있는 형태로 장내에는 α-galactosidase 효소가 결핍되어 있어 sucrose와 galactose로 분해 시키지 못하기 때문에 난소화성인 것으로 밝혀져 있다(Suarez et al., 1999). 난소화성당은 분해되지 않은 상태로 대장에 도달하게 되고, 대장 내의 혐기성 미생물에 의해 분해되면 서 가스가 발생하면서 장을 불편하게 하고 체외로 배출시켜 불쾌감을 주는 것으로 알려져 있다(Murphy et al., 1972). 콩 성숙 종자에서 raffinose 및 stachyose의 함량이 낮은 유전자 원이 밝혀져 있다(Kerr and Sebastian, 2000). Dierking와 Bilyeu (2008)는 PI200508로부터 RS2라는 raffinose synthase 의 새로운 allele를 발견하였고. RS2 gene은 raffinose 함량 을 낮게 한다고 하였다. Hou et al. (2009)은 유전자형, 성숙 군, 원산지에 따른 raffinose 및 stachyose의 함량 변이를 보 고하였고, Kumar et al. (2010)은 재배환경에 따른 함량의 변이를 보고한 바 있다. Neus et al. (2005)은 정상계통과 raffinose 및 stachyose의 함량이 적은 계통간 농업적 형질의 차 이를 보고하였다. 한편 국내에서는 Choung (2005)이 32개의 장 려품종과 468개의 유전자원을 이용하여 soluble carbohydrate인 glucose, sucrose, raffinose 및 stachyose의 함량 변이를 보고 하였으며. NIRS을 이용하여 sucrose, raffinose 및 stachyose 의 함량을 빠르게 분석하는 방법을 보고하였다(Choung, 2010). 콩의 맛과 품질을 높이기 위해서는 sucrose의 함량이 높은 콩 계통의 선발이 필요하지만 반면에 raffinose 및 stachyose 의 함량은 적은 품종의 육성이 요구된다. 따라서, 본 연구의 목적은 raffinose 및 stachyose의 함량이 적은 콩 품종 육성 을 위하여 요구되는 기본정보를 얻기 위하여 장려품종, 육 성계통, 유전자원을 이용하여 유전자원간 년차간 raffinose 및 stachyose의 함량변이를 관찰하고자 수행되었다.
재료 및 방법
유전자원
콩의 genotype 및 environment에 따른 성숙종자에 존재 하는 raffinose 및 stachyose의 함량 변이에 대한 정보를 얻 기 위하여 전체 22개의 유전자형을 이용하였다(Table 1). 국내 장려품종 11 품종, 3개의 유전자원, 8개의 breeding line 을 이용하여 2012년 및 2013년 부속농장 전작포장에 6월 10일 70 × 15 cm의 재식거리로 파종하여 1주 1본을 유지 하였다. 시험구 배치는 완전임의배치법 2반복으로 하였다.
Table 1.
List of 22 genotypes used and raffinose and stachyose content(g/kg) for two years.
| Genotype | Class1) | Stachyose | Raffinose | ||
|---|---|---|---|---|---|
| Year 1 | Year 2 | Year 1 | Year 2 | ||
| CJ#1 | C | 17.78±1.512) | 21.50±0.42 | 4.19±0.17 | 6.44±0.18 |
| Gaechuck#1 | C | 15.93±2.06 | 19.45±1.36 | 3.32±0.60 | 4.69±1.60 |
| Gaechuck#2 | C | 18.13±1.00 | 21.18±0.93 | 4.28±0.56 | 6.40±0.46 |
| Gyeongsang#1 | C | 15.61±0.52 | 17.42±0.88 | 2.96±0.04 | 7.51±0.02 |
| Gyeongsang#3 | C | 22.77±1.79 | 23.87±0.19 | 3.99±0.16 | 6.36±0.58 |
| Jinpum#2 | C | 27.68±9.90 | 22.43±1.22 | 5.25±2.95 | 5.93±1.42 |
| Jinnong#1 | C | 18.06±1.16 | 19.58±4.16 | 3.18±0.57 | 6.37±0.16 |
| Jinnong#2 | C | 23.10±0.63 | 24.39±3.63 | 4.16±1.68 | 5.90±0.46 |
| Taekwangkong | C | 14.69±2.21 | 17.52±2.06 | 3.01±0.59 | 4.69±1.99 |
| Pumsannamulkong | C | 12.92±1.44 | 16.18±1.12 | 3.17±1.28 | 4.94±2.56 |
| Hwangkumkong | C | 15.97±2.74 | 17.93±3.78 | 2.86±0.97 | 5.24±0.98 |
| PI506903 | G | 19.41±4.27 | 23.86±2.33 | 3.31±0.32 | 4.97±0.24 |
| PI507226A | G | 16.70±3.92 | 23.60±1.42 | 5.87±2.43 | 7.80±1.29 |
| PI507487 | G | 18.71±2.47 | 17.36±2.20 | 4.15±0.67 | 6.47±1.90 |
| Da-7 | B | 6.75±1.39 | 5.28±0.28 | 3.98±0.35 | 3.24±0.37 |
| P34-162 | B | 23.53±1.27 | 25.20±1.10 | 2.68±0.21 | 4.57±0.49 |
| 10R9 | B | 18.91±4.67 | 20.53±0.18 | 5.53±0.21 | 9.05±0.16 |
| RS-78 | B | 4.23±0.98 | 6.87±0.47 | 3.51±0.26 | 4.75±0.89 |
| 116-13 | B | 4.38±1.29 | 5.11±1.09 | 3.67±1.16 | 3.35±0.34 |
| 70F7-1 | B | 22.83±3.90 | 25.45±0.02 | 4.43±2.46 | 5.08±0.23 |
| 70F7-2 | B | 20.12±0.88 | 25.32±0.35 | 3.69±1.42 | 5.36±0.60 |
| 09M1 | B | 14.89±0.16 | 19.82±1.93 | 3.41±0.93 | 8.72±0.48 |
Raffinose 및 stachyose 함량 분석
포장에 파종된 22개의 유전자형에 대하여 성숙시 수확하여 자연 건조 후 유전자형별로 random 종자를 선발하여 raffinose 및 stachyose의 함량을 분석하기 위한 시료로 사용하였다. 선발된 성숙 종자를 막자와 사발을 이용하여 파쇄 한 후 분 말 200 ㎎을 취해 3 ml의 acetone 처리를 하고 60°C의 water bath에 두어 2시간 동안 반응시킨 후, 이를 2000 rpm으로 5분간 원심분리하여 침전물을 취함으로서 지방질을 제거하 였다. 침전물을 약 60°C의 heating block에서 열처리하여 남은 유기용매를 완전히 제거하였고, 삼차 증류수 1.9 ml을 가하여 60°C의 water bath에 2시간 동안 둔 후 0.1 ml의 1M 5-SSA (5-sulfosalicylic acid)를 첨가하여 4°C에 두고 overnight 시켰다. 이를 3000 rpm으로 5분간 원심분리하여 침전물은 버리고 상등액을 취하여 시료에 포함된 단백질을 비롯한 방 해물질을 제거한 후 상등액 0.8 ml에 동량의 삼차 증류수를 넣고 4°C에서 12000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 0.2 μm membrane filter에 상등액을 여과시킨 후 4°C 에 보관하여 HPLC (High performance liquid chromatograhpy) 로 raffinose 및 stachyose 함량을 분석하였다. 사용된 HPLC 는 Agilent 1100 series (Agilent Technologies, USA)이며, RI (reflective index) detector를 사용하였다. 분석 column은 Supelcogel 610-H column (300 × 7.8 mm i.d., 9 μm, Supelco, USA)을 사용하였으며, elution solvent는 0.1% H3PO3 수용 액을 사용하였고, 이동상의 flow rate는 0.6 ml/min, 시료의 주입량은 10 μl이었다. 각각의 표준용액은 100 mg/ml을 삼 차 증류수에 용해하여 stock solution으로 갈색 유리병에 냉 장보관한 후, 희석하여 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 mg/ml로 하여 각각의 chromatogram을 얻었으며 peak의 면적당 표준 용액 농도의 관계로 검량선을 작성하여 시료의 raffinose 및 stachyose 함량 정량분석에 적용하였다.
통계처리는 SAS 프로그램을 이용하여 분산분석, 덩컨의 다중검정, 상관관계 및 유의성 분석을 실시하였다.
결과 및 고찰
Raffinose와 stachyose의 함량변이
유전자형 및 재배환경에 따른 콩 성숙 종자에 함유되어져 있는 raffinose 및 stachyose의 함량 변이를 관찰하기 위하 여 22개의 유전자형을 선발하여 2년(2012년, 2013년)간 재 배 후 함량을 분석하였으며 soluble carbohydrate의 HPLC 분석 peak는 Fig. 1과 같다. Table 1은 이용된 22개의 유전 자형과 년차간 함량을 나타낸다. 1년차(Year 1, 2013년) 실 험결과 raffinose의 함량은 2.68±0.21 - 5.87±2.43 g/kg의 범 위를 보였으며 Hwangkumkong에서 가장 낮았으며 PI507226A 유전자원이 가장 높은 값을 보였다. 2년차(Year 2, 2014년) 에서는 3.24±0.37 - 9.05±0.16 g/kg의 범위를 보였고 Da-7 계통에서 가장 낮았으며 반면에 10R9 계통에서 가장 높았다. Stachyose의 함량은 1년차에서는 4.23±0.98 - 27.68±9.90 g/kg의 범위를 보였으며 RS-78 계통에서 가장 낮았으며 Jinpum#2에서 가장 높은 값을 보였다. 2년차(Year 2, 2014 년)에서는 5.11±1.09 - 25.32±0.35 g/kg의 범위를 보였고 116-13 계통에서 가장 낮았으며, 70F7-2 계통에서 가장 높 았다. 선발된 22개의 유전자형을 이용한 2년간 실험결과 stachyose의 함량이 raffinose의 함량보다 높았고 년차에 따 라 함량의 값에서 차이를 보였다.
Fig. 1.
HPLC chromatogram of the soluble carbohybrates in soybean seeds (peak 7.472=stachyose, peak 7.830=raffinose, peak 8.553=sucrose).유전자형 및 년차에 따른 stachyose 및 raffinose의 함량 에 대한 분산분석 결과는 Table 2와 같다. 유전자형과 년차 간 stachyose 및 raffinose의 함량은 고도의 유의성을 보였 고 상호작용은 인정되지 않았다.
Table 2.
Mean squares from analysis of variance of stachyose and raffinose content(g/kg) for soybean genotypes during 2013 and 2014 year.
| Source | df | Mean Squares | |
|---|---|---|---|
| Stachyose | Raffinose | ||
| Genotype (G) | 21 | 139.42** | 4.15** |
| Year (Y) | 1 | 99.34** | 85.06** |
| G × Y | 21 | 6.54 | 1.88 |
| Error | 44 | 6.44 | 1.29 |
22개의 유전자형을 이용한 콩 성숙 종자에서 raffinose 및 stachyose의 함량은 유전자형에 따라 차이를 보여(Table 1, 2) 유전적 개량이 가능함을 보였다. 이러한 결과는 이전의 연구자들이 보고한 결과와 유사하였다. Hou et al. (2009)은 241개의 유전자원을 대상으로 stachyose 및 raffinose의 함 량을 조사하였는데 stachyose의 함량은 0.2 - 69.6 mg/g 범 위였고 raffinose의 함량은 0.1 - 19.9 mg/g로 성숙군, 원산 지, 유전자형에 따라 함량에서 다양한 변이를 보고하였다. Kumar et al. (2010)은 148개의 유전자형을 재료로 raffinose 함량은 0.64 - 2.53 mmol/100g, stachyose 함량은 2.09 - 7.1 mmol/100g로 보고하여 raffinose와 stachyose 함량은 재배 지역 및 유전자형에 영향을 받는다고 하였다. Choung (2005) 은 32개의 국내 장려품종을 재료로 raffinose의 함량은 0.86 - 1.78%, stachyose의 범위는 1.36 - 3.32%의 범위로 품종 간 차이를 보고하였다. 장려품종을 제외한 468개의 유전자 원에서는 raffinose가 0.08 - 1.87%, stachyose가 0.75 - 3.18%의 범위로 함량변이가 더 심함을 보고하였다.
Raffinose와 stachyose 함량의 년차간 변이
본 연구에서 이용된 22개의 유전자형에 대한 stachyose 및 raffinose의 평균간 차이는 Table 3과 4와 같다.
Table 3.
Mean rank and mean of 22 genotypes for stachyose content (g/kg) averaged two replication across 2 years.
| Mean Rank | Stachyose | |||
|---|---|---|---|---|
| Year 1 | Year 2 | |||
| Genotype | Mean1) | Genotype | Mean1) | |
| 1 | Jinpum#2 | 27.68a | 70F7-1 | 25.45a |
| 2 | P34-162 | 23.53ab | 70F7-2 | 25.32a |
| 3 | Jinnong#2 | 23.10abc | P34-162 | 25.20a |
| 4 | 70F7-1 | 22.83abc | Jinnong#2 | 24.39ab |
| 5 | Gyeongsang#3 | 22.77abc | Gyeongsang#3 | 23.87abc |
| 6 | 70F7-2 | 20.12bcd | PI506903 | 23.86abc |
| 7 | PI506903 | 19.41bcd | PI507226A | 23.60abc |
| 8 | 10R9 | 18.91bcd | Jinpum#2 | 22.43abc |
| 9 | PI507487 | 18.71bcd | CJ1#1 | 21.50abcd |
| 10 | Gaechuck#2 | 18.13bcd | Gaechuck#2 | 21.18abcd |
| 11 | Jinnong#1 | 18.06bcd | 10R9 | 20.53bcde |
| 12 | CJ1#1 | 17.78bcd | 09M1 | 19.82cde |
| 13 | PI507226A | 16.70bcd | Jinnong#1 | 19.58cde |
| 14 | Hwangkumkong | 15.97cd | Gaechuck#1 | 19.45cde |
| 15 | Gaechuck#1 | 15.93cd | Hwangkumkong | 17.93de |
| 16 | Gyeongsang#1 | 15.61cd | Taekwangkong | 17.52de |
| 17 | 09M1 | 14.89d | Gyeongsang#1 | 17.42de |
| 18 | Taekwangkong | 14.69d | PI507487 | 17.36de |
| 19 | Pumsan- | 12.92de | Pumsan- | 16.18e |
| namulkong | namulkong | |||
| 20 | Da-7 | 6.75ef | RS-78 | 6.87f |
| 21 | 116-13 | 4.38f | Da-7 | 5.28f |
| 22 | RS-78 | 4.23f | 116-13 | 5.11f |
Table 4.
Mean rank and mean of 22 genotypes for raffinose content (g/kg) averaged two replication across 2 years.
| Mean Rank | Raffinose | |||
|---|---|---|---|---|
| Year 1 | Year 2 | |||
| Genotype | Mean1) | Genotype | Mean1) | |
| 1 | PI507226A | 5.87a | 10R9 | 9.05a |
| 2 | 10R9 | 5.53ab | 09M1 | 8.72ab |
| 3 | Jinpum#2 | 5.25ab | PI507226A | 7.80abc |
| 4 | 70F7-1 | 4.43ab | Gyeongsang#1 | 7.51abcd |
| 5 | Gaechuck#2 | 4.28ab | PI507487 | 6.47bcde |
| 6 | CJ#1 | 4.19ab | CJ#1 | 6.44bcde |
| 7 | Jinnong#2 | 4.16ab | Gaechuck#2 | 6.40bcde |
| 8 | PI507487 | 4.15ab | Jinnong#1 | 6.37bcde |
| 9 | Gyeongsang#3 | 3.99ab | Gyeongsang#3 | 6.36bcde |
| 10 | Da-7 | 3.98ab | Jinpum#2 | 5.93cde |
| 11 | 70F7-2 | 3.69ab | Jinnong#2 | 5.90cde |
| 12 | 116-13 | 3.67ab | 70F7-2 | 5.36cdef |
| 13 | RS-78 | 3.51ab | Hwangkumkong | 5.24def |
| 14 | 09M1 | 3.41ab | 70F7-1 | 5.08def |
| 15 | Gaechuck#1 | 3.32ab | PI506903 | 4.97def |
| 16 | PI506903 | 3.31ab | Pumsan-namulkong | 4.94ef |
| 17 | Jinnong#1 | 3.18ab | RS-78 | 4.75ef |
| 18 | Pumsan-namulkong | 3.17ab | Gaechuck#1 | 4.69ef |
| 19 | Taekwangkong | 3.01ab | Taekwangkong | 4.69ef |
| 20 | Gyeongsang#1 | 2.96ab | P34-162 | 4.57ef |
| 21 | Hwangkumkong | 2.86b | 116-13 | 3.35f |
| 22 | P34-162 | 2.68b | Da-7 | 3.24f |
Stachyose 함량에서는 2년간 모두 유전자형에 따라 5% 유의수준에서 평균함량에서 차이를 보였고 이는 이전의 연구 자들과 같은 경향이었다. 2년차 평가 모두에서 Da-7, 116-13, RS-78 유전자형은 유의하게 낮은 함량을 보였다. 주요 장 려품종 중에서는 Jinpum#2가 2년 모두 가장 높은 값을 보 였다. 22개의 유전자형을 높은 평균 함량을 기준으로 순서 로 볼 때 3개의 유전자형(Gyeongsang#3, Gaechuck#2, Pumsannamulkong) 은 2년 동일했으며, 4개의 유전자형(PI507226A, Jinpum#2, 09M1, PI507487)은 년차에 따라 순서의 변동이 심하였다. 이러한 결과는 stachyose의 함량은 유전자형에 따라 환경의 영향을 받는 정도에서 차이가 있음을 나타내었 다. Raffinose 함량의 경우 2년간 모두 유전자형에 따라 5% 유의수준에서 평균함량에서 차이를 보였으며 stachyose의 함량보다 변이가 작았고 콩 종실에서 이들이 차지하는 비율 은 이전의 연구자들과 같은 경향이었다. 1년차 평가 에서는 Hwangkumkong 및 P34-162 유전자형이 낮은 값을 보였고 2년차에서는 116-13과 Da-7 유전자형이 낮은 값을 보였다. 3개의 유전자형(CJ#1, Gyeongsang#3, Taekwangkong)은 함량 의 순서에서 2년간 동일하였으며 환경에 따른 함량의 차이 는 stachyose와 마찬가지로 유전자형에 따라 차이가 있었다.
Raffinose와 stachyose 함량의 상관
22개의 유전자형을 이용한 raffinose 및 stachyose의 함량 에서 년차간에 나타나는 상호관계는 Fig. 2와 같다. 2년차 모두 stachyose의 함량이 raffinose의 함량보다 높고, raffinose 의 함량이 높아지면 stachyose의 함량도 높아지는 정의 상 관관계를 보였다. 그러나 1년차에서는 통계적으로 유의성 이 인정되지 않았으나 2년차에서는 5% 유의수준에서 유의 하였고(R2=0.1985*) 이러한 결과는 raffinose와 stachyose의 함량간에는 r=0.68로 높은 정의 상관관계을 보고한 이전의 연구결과(Hou et al. 2009)와 유사하였다. 이러한 결과는 콩 에서 raffinose 및 stachyose의 성분과 관련된 유전 육종연 구를 위한 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
적 요
콩 성숙 종자에 존재하는 raffinose 및 stachyose의 함량 이 적은 콩 품종 육성을 위하여 요구되는 기본정보를 얻기 위하여 장려품종, 육성계통, 유전자원등 22개의 유전자원과 2년간 함량변이를 관찰한 결과는 아래와 같았다.
Raffinose의 함량(g/kg)은 1년차의 경우 2.68±0.21 - 5.87±2.43의 범위를 보였고 2년차에서는 3.24±0.37 - 9.05±0.16의 범위를 보였다.
Stachyose의 함량(g/kg)은 1년차에서 4.23±0.98 - 27.68 ±9.90, 2년차에서는 5.11±1.09 - 25.32±0.35의 범위를 보였다.
분산분석 결과 유전자형과 년차간 stachyose 및 raffinose 의 함량은 고도의 유의성을 보였고 상호작용은 인정되 지 않았다.
Stachyose 함량에서는 2년차 평가 모두에서 Da-7, 116-13, RS-78 유전자형이 유의하게 낮은 함량을 보였다.
Raffinose 함량은 1년차 평가에서 Hwangkumkong 및 P34-162 유전자형이 낮은 값을 보였고, 2년차에서는 116-13과 Da-7 유전자형이 낮은 값을 보였다.
Raffinose와 stachyose의 함량간에는 2년차 평가에서 유의한 정의 상관관계(R2=0.1985*)을 보였다.
